[发明专利]一种重组稀有鮈鲫雌激素受体双杂交酵母gERβ1-GRIP1及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组稀有鮈鲫雌激素受体双杂交酵母gERβ1-GRIP1及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

环境中的内分泌干扰物，亦被称为环境激素，是指能够影响动物的内分泌系统机能，对个体及其后代或者群体(部分亚群体)造成损害的外源性化学物质或混合物。美国环境保护局(EPA)描述了其影响内分泌系统的具体过程：对生物的正常行为及生殖、发育相关的正常激素的合成、贮存、分泌、体内输送、结合及清除等过程产生妨碍作用。环境中的内分泌干扰物的干扰效应包括：雌激素干扰效应、雄激素干扰效应、甲状腺激素干扰效应等，特别是雌激素干扰效应能够对生物及人类生殖系统造成严重影响。尽管具有雌激素干扰活性的化合物在环境中浓度极小，但是其一旦进入人体和动物体内，可以与特定的雌激素受体(ER)结合形成复合物，该复合物进一步与细胞核内的雌激素反应元件(ERE)结合，启动特定基因的表达，产生相应的生理生化效应，干扰内分泌系统的正常功能。

20世纪90年代对雌激素受体作用机制的研究进一步发现了雌激素受体的共激活因子(co activator)(Hong,H.,Kohlit,K.,Trivedit,A.,Deborah,L.,Johnson,D.L.和Stallcup,M.R.,1996,Natl.Acad.Sci.USA.93:4948-4952)。雌激素(或者环境中类雌激素物质)与相应雌激素受体的配体结合区(LBD)结合后形成复合物并引起构象改变，进一步结合受体共激活因子，促进下游基因的转录。

通常采用化学分析和生物测试技术对环境中雌激素干扰效应进行研究。化学分析法需要高分辨色谱/高分辨质谱，除了分析费用高外，对仪器设备条件和人员素质有相当严格的要求。生物测试技术中重组雌激素受体基因双杂交酵母的方法，模拟了体内雌激素受体的作用机制，将雌激素受体基因片段和受体共激活因子基因片段同时导入酵母细胞，用以筛选配体化合物对下游基因转录的影响。该方法不仅可以克服了单杂交酵母菌种一旦发生回复突变，性状很难回复的缺点，对测定环境化合物的雌激素干扰效应时也能够更好的进行质量控制。且有证据表明核受体双杂交酵母系统更加接近哺乳动物内分泌系统的真实作用情况(Nishihara,T.，Nishikawa,J.,2000,Journal of Health Science.46(4):282-298)。与化学分析法相比，生物检测方法具有操作简单、快速、经济、高效的优点，并且能直接测定环境样品的内分泌干扰活性，表征可能的生态毒理效应。该类方法也存在不足之处，任何一种单一的生物检测方法都只能提供有限的证据。

北美萤火虫(Photinus pyralis)的荧光素酶(Luciferase)是一个62kDa的单酶体，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。荧光素酶在ATP、O₂以及Mg²⁺存在时，添加底物荧光素(D-luciferin)就会发出黄绿色的光。荧光素酶生物发光反应过程通常分为以下两步：荧光素+三磷酸腺苷(ATP)→荧光素化腺苷酸(luciferyladenylate)+焦磷酸(PPi)；荧光素化腺苷酸+O₂→氧荧光素+磷酸腺苷(AMP)+光。因此，通过简单测定荧光素酶生物发光的强度，就能够表征暴露化合物对报告基因转录的影响。名称为“重组荧光双杂交酵母及其检测方法与应用”、授权公告号为CN 102127561B的发明专利中公开了重组酵母，其基因型为MATα,ura 3-5,ade 2-101trp 1-901,leu 2-3,112,gal4△,met-,gal80△,URA::GAL1UAS-GAL1TATA-Luc。该重组酵母以酵母菌株Y187为骨架，Luc基因被整合到酵母染色体中GAL1UAS-GAL1TATA下游受其调控。与Y187相同的是，该重组酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。与Y187不同的是，该重组酵母具有HIS合成能力。该重组酵母基于GAL4系统，目前所有已知的该系统质粒均可根据需要在该宿主内复制或表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是检测样品中的天然雌激素和/或类雌激素化合物的浓度。