[发明专利]一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶的免疫应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶的免疫应用。

背景技术

迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性细菌，能够感染多种养殖经济鱼类，包括大菱鲆、牙鲆、罗非鱼等。迟缓爱德华氏菌感染鱼类后可诱发迟缓爱德华氏菌病(edwardsielosis)，该病可导致被感染鱼类的爆发性大量死亡，由此对养殖业造成严重经济损失。虽然针对迟缓爱德华氏菌的疫苗研究近年来已有多个报道，但是迄今为止国内对迟缓爱德华氏菌病尚无有效防范措施。另外，一种疫苗往往难以达到理想的保护效果，针对病原不同靶点的多种不同疫苗交叉使用有可能取得更好的效果，因此需要研发多种不同的迟缓爱德华氏菌疫苗。

发明内容

本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶的免疫应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶，以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pET259连接，获得质粒pETArl，转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组蛋白酶。

所述引物为F1：5’-GCCATTAATATGTTTAATTTGCTTGGTTATATTTATTAC-3’；R1：5’-GCCCTCGAGTTCAAAGGGGAAGATCTCCG-3’；

所述蛋白用于制备免疫疫苗本发明具有如下优点：

1.显著保护性。本发明的迟缓爱德华氏菌蛋白酶作为疫苗对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率达53％。

2.本发明的疫苗无需商业化佐剂。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的蛋白酶(泳道2)的电泳图。泳道1，分子量标准。

图2为本发明实施例提供的纯化的蛋白酶的酶活检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

重组迟缓爱德华氏菌蛋白酶rArl的制备

步骤1)rArl的表达载体pETArl的构建：

迟缓爱德华氏菌蛋白酶Arl的序列已被报道(GenBank access ion number.YP_003296070.1)。Ar1由450个氨基酸组成，有一个保守的HEXXH结构域。pETArl的构建如下：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用引物F1/R1扩增Arl基因。PCR条件为：94℃ 60s预变性模板DNA,然后94℃ 40s,53℃ 60s,72℃ 60s,5个循环，然后94℃ 40s,61℃ 60s,72℃ 60s,30个循环。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(pET259构建过程参见Hu YH,Zheng WW,Sun L.Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum(Sciaenops ocellatus).Fish Shellfish Immunol 2010；28:678-86)用限制性内切酶SwaI酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pETArl。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水；

所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.2330，保藏日期为2008年1月9日，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。