[发明专利]一种促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的制备方法及其临床应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞的方法以及通过所述方法获得过表达BMP4的神经干细胞，特别地，本发明涉及的过表达BMP4的神经干细胞体外实验中BMP-4与BMP受体结合活化，可以促进胶质瘤干细胞分化，体内实验中能转移到肿瘤病灶位，抑制胶质瘤的生长和转移复发；本发明的过表达BMP4的神经干细胞可以用于临床治疗胶质瘤，针对性促肿瘤干细胞分化，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，降低胶质瘤恶性程度从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。

背景技术

胶质细胞瘤中的胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是最常见的致死性，恶性程度最强的颅内肿瘤。肿瘤细胞在脑内广泛迁移，病情恶性进展迅速。切除手术结合传统的放、化疗很难做到根治不复发，平均生存期不足1年。目前的治疗方法虽经多重改善，但对具有高侵袭性的GBM仍束手无策。原因是肿瘤本质上具有抵抗化学疗法和放射治疗的能力或在治疗过程中获得此种能力。而执行这一能力的可能是胶质瘤干细胞(Glioma stem cells，GSC)，近年来，将干细胞生物学理论用于人脑肿瘤的研究发现，人类GBM中存在一种具有干细胞特征的细胞亚群，被称为脑肿瘤干细胞或肿瘤起源细胞。

GBM中的脑肿瘤干细胞同神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)表达相同的膜抗原CD133和巢蛋白(Nestin)，它们在体外培养可形成神经球，能够自我复制、增殖并产生胶质瘤组织中其它分化类型的肿瘤细胞。GBM起源细胞的发现为GBM的高侵袭性、高复发性提供了新的解释。最近研究证明GBM中的脑肿瘤干细胞多存在于血管壁龛内，是造成肿瘤放、化疗抗性的主要原因。而目前应用的化疗药物及放射治疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对脑内正常NSCs的杀伤作用更大，因此极大地限制了它们的应用。靶向杀伤、抑制GBM中的脑肿瘤干细胞的治疗策略为GBM的治疗提供了新的思路。

本发明提供了一种在胶质母细胞瘤中基因沉默的骨形态发生蛋白4(bone morphogen protein 4，BMP4)，BMP4/BMP受体系统抑制造成胶质瘤干细胞增殖和成球生长，使得胶质瘤生长和转移复发。然而，提高BMP4在胶质瘤中的表达，激活BMP4/BMP受体系统促进胶质瘤干细胞终末分化，抑制了GBM细胞的生长。本发明以人神经干细胞作为载体过表达BMP4，促进胶质瘤干细胞终末分化，能有效地抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，从而抑制GBM的生长与转移复发。人神经干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产，是基因表达理想的载体，因而，本发明促胶质瘤干细胞分化的过表达BMP4的神经干细胞制备简单，能个体化临床治疗胶质瘤患者，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗胶质瘤。

发明内容

胶质母细胞瘤高度不均一性，分为三个等级，最高级的是肿瘤干细胞，位于塔顶，接下来是分化阶段的肿瘤祖细胞，位于塔底的是已分化的大量肿瘤细胞。现在的治疗往往针对的是肿瘤实体中的分化细胞，而忽视了前两种细胞，虽然这些干细胞只占胶质母细胞瘤的很小一部分，但很可能负责肿瘤的起源和生长，侵袭和复发及远处播散。胶质瘤干细胞具有下列特性：自我更新、无限增殖、多向分化潜能、表达神经干细胞的标志物、培养于干细胞培养基中能形成细胞球、极小数量接种于免疫缺陷小鼠颅内能独立成瘤。GSCs的起源至今未明，可能来源于遗传或表观遗传突变的神经干细胞或祖细胞，或者星形胶质细胞经过一系列的突变或重新编程而来。GSCs比一般细胞对放射治疗和化学治疗更容易耐受。GSCs的这些特性被视为是胶质母细胞瘤恶性表型和术后复发的根源，GSCs是胶质母细胞瘤的“种子细胞”，针对GSCs的研究或治疗更能模拟胶质母细胞瘤的真实情况，可见GSCs已成为研究治疗脑胶质母细胞瘤的新工具。

本发明是我们长期通过基础研究的科研成果，发现BMP4在胶质瘤发生发展中发挥着重要作用，是胶质瘤干细胞赖以生存的抑制分子。我们研究发现BMP4可通过靶向多个基因，骨形态发生蛋白(BMPs)在调节正常NSCs分化的过程中发挥着十分重要的作用。对胚胎早期的NSCs，BMPs主要促进其增殖。相反，对于从胚胎后期或出生后动物分离到的NSCs，BMPs的作用是促其向星形胶质细胞分化。BMP4表达于成熟的星形胶质细胞，而在NSCs、神经元和少突胶质细胞中不表达，该结果提示BMP4是正常脑星形胶质细胞分泌的细胞因子，对正常脑组织是安全无害的，而且可以通过基因修饰在NSC中过表达。