[发明专利]一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用

权利要求书

1.一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法，其特征在于，出生后纯合敲除小鼠表现腭裂症状，包括如下步骤：

构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，步骤如下：

(1)提取含有loxl3基因的细菌人工染色体(BAC)；

(2)PCR扩增六段同源重组片段，所述的引物序列分别为：

同源重组片段A：F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；

R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；

同源重组片段B：F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；

R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；

同源重组片段C：F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；

R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；

同源重组片段D：F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTCCAGAGCATCGCTCAC；

同源重组片段E：F：CCGCTCGAGCTGGACTAGCCCGGACATTAT；

R：GGAATTCCATTCGGATACCATTCACCTGC；

同源重组片段F：F：CGGGATCCACCAGCAAGCAGGAACTCAT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCTGTTTGTTTCTGTGCCAAGC；

(3)分别将同源重组片段A和同源重组片段B连入质粒pL253，同源重组片段C和同源重组片段D连入质粒pL452，同源重组片段E和同源重组片段F连入质粒pL451，分别制得重组质粒pL253+A+B、重组质粒pL452+C+D、重组质粒pL451+E+F；

(4)将含有loxl3基因的BAC转化入EL350菌株，然后通过第一次同源重组，将质粒pL253+A+B转化入含有BAC的EL350菌株，获得Retrieved质粒；再通过第二次同源重组，将重组质粒pL452+C+D和Retrieved质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+Neo+D+B片段的二次同源重组质粒；利用Cre-loxP系统去除Neo序列，获得去掉Neo的二次同源重组质粒；最后通过第三次同源重组，将重组质粒pL451+E+F和去掉Neo的二次同源重组质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+D+E+Neo+F+B片段的三次同源重组质粒，即为Loxl3条件性基因敲除的重组载体；

线性化重组载体并转染胚胎干细胞；

筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；

将筛选出的发生同源重组的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚；

将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；

嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠；

将该杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的EIIa-Cre小鼠交配，获得双杂合的小鼠；

雌性和雄性双杂合小鼠互交，从后代中获得具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干细胞为129/S6来源的胚胎干细胞。

3.利用权利要求1所述的方法获得的纯合基因敲除小鼠作为腭裂疾病发病研究的模型鼠的用途。