[发明专利]BC-02的液相色谱检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学检测领域，具体涉及一种BC-02的液相色谱检测方法。

背景技术

BC-02（Bestatin-5Fu衍生物）山东大学药学院自主研发的一种新型抗肿瘤新药。通过将抑制肿瘤干细胞的乌苯美司与细胞毒类抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）骈合到一起，协同发挥疗效，实现多靶点型抗肿瘤作用，为抗肿瘤新药研究开辟了新的领域。

最近研究表明，在小鼠肝癌移植瘤实验中，比较单独使用乌苯美司、5-氟尿嘧啶和联合使用两种药物，结果发现，联合组表现出了极高的抑瘤活性。这一研究结果为乌苯美司与5-氟尿嘧啶及其他化疗药物的联合应用提供了很好的实验证据(J Clin Invest 2010,120,3326-3339)。也证实了BC-02在肿瘤化疗中同时抑制肿瘤干细胞的重要性。

                                                 

目前，尚无此类新型药物质量标准控制的分析方法及相关研究。为了进一步开发BC-02，使之成为CFDA正式批准的国家1.1类新药，有关其含量和杂质的测定分析方法成了研究的重点。系统研究BC-02杂质和含量的检测方法，是确保药物BC-02安全性、有效性和稳定性必要的技术手段和方法依据。BC-02在合成过程和储存过程中会产生多种杂质，这些杂质在结构、理化性质及药理毒理等方面均与主成分存在相关性，为做好工艺过程控制，有效分离相关杂质，提高BC-02产品质量，研究尝试用高效液相色谱分析法，检测BC-02杂质，同时检测其主成分的含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种BC-02的液相色谱检测方法，能够精确测定BC-02的含量，以及检测BC-02中的杂质含量。

本发明提供的一种BC-02的液相色谱检测方法，包括以下步骤：

（1）取BC-02标准品采用水制备BC-02标准溶液，或取BC-02标准品和5-Fu标准品采用水制备混合标准溶液；

（2）取待测样品采用水制备待测样品溶液；

（3）系统适用性试验：取0.5mg/ml 5-Fu水溶液100μl和10mg BC-02用水稀释定容到10ml容量瓶中，配制成系统适用性溶液，取系统适用性溶液进样20μl，5-Fu与BC-02以及杂质与BC-02之间的分离度R＞1.5；

（4）取步骤（2）配制的待测样品溶液5～20μl注入液相色谱仪，流动相流速为0.5～1.5mL/min，检测波长为：200～300nm；检测器：PAD、柱温为30～40℃；

所述流动相包括A相和B相，A相为甲醇-水；B相为乙腈-水-TFA-TEA；A相与B相的体积比为10:90，所述的A相中甲醇与水体积比5:95，用磷酸调节pH值为3.5，B相中乙腈、水、TFA和TEA的体积比为25:75:0.15:0.1；

（5）采用步骤（4）检测条件测定步骤（1）配制的标准溶液或混合标准溶液，以外标法计算待测样品中BC-02或者BC-02中杂质的含量。

步骤(1) 所述BC-02标准品的纯度大于99％，为了保证标准品纯度，使用前可进行重结晶处理；所述5-Fu标准品的纯度大于99％。

步骤(1) 所述BC-02标准溶液质量浓度为0.05～1.5mg/mL；混合标准溶液质量浓度为0.002～0.015mg/mL，优选待测样品溶液浓度的0.1%。

步骤（1）混合标准溶液配制方法为，先分别配制0.5mg/ml的5-Fu标准品的水溶液和1mg/ml的BC-02标准品的水溶液，分别取以上两种溶液各100μl置同一10ml容量瓶中，用水稀释定容，得到5-Fu浓度5μg/ml、BC-02浓度10μg/ml的混合标准溶液。

步骤(2) 所述待测样品溶液的质量浓度为0.05～1.0mg/mL。

步骤(1) 和（2）所述标准溶液、混合标准溶液和待测样品溶液注入液相色谱仪之前通过孔径为0.2～0.5μm的过滤膜过滤。

本发明方法所用液相色谱仪的色谱柱为C₁₈柱，柱长150～300mm，其中，色谱柱填料优选用于亲水性样品分离和在含高比例水的流动相条件下具有强的保留的填料。色谱柱优选型号phenomenex，柱长250mm，直径4.6mm，孔径5μm，填充剂为C₁₈键合烷基硅胶、粒径100A。

本发明方法中，测定BC-02含量时采用BC-02标准溶液，等度洗脱方法；测定BC-02中的杂质含量时采用混合标准溶液，梯度洗脱方法。