[发明专利]一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。

背景技术

鳜鱼（Siniperca chuatsi）是我国重要的淡水特色养殖品种之一，而近年来由传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）引起的鳜虹彩病毒病给鳜鱼养殖产业造成了严重的经济损失。1997年，吴淑勤等首先在患病鳜鱼中发现了直径150nm的球形病毒，并认为是鳜鱼暴发性传染病的病原。1998年，何建国等通过回归感染进一步证明了该病毒的病原性，通过组织学研究发现鳜鱼脾脏和肾脏是其感染的主要器官，将其命名为传染性脾肾坏死病毒，并通过主衣壳蛋白（MCP）基因等序列分析确定其为一种虹彩病毒。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第八次报告，ISKNV是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种，其传染力强，发病率高达30％，致死率高达90％以上，可以感染近60种淡水和海水鱼，给鳜鱼、加洲鲈、乌鳢、美国红鱼、石斑鱼等海淡水鱼类养殖业造成了巨大威胁。自1994年以来，ISKNV给我国鳜鱼养殖业造成的平均年经济损失高达2亿元，是制约鳜鱼养殖业健康发展的主要瓶颈。

免疫接种是预防传染病发生的主要手段，付小哲实验室建立了ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB，研制出细胞培养灭活疫苗。但如何以低成本生产获得高滴度病毒是疫苗制备的关键步骤。病毒接种方法有两种，同步接毒和异步接毒。同步接毒法是在细胞传代同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗(细小病毒)；异步接毒法是在细胞形成单层后接种毒种，如流行性乙型脑炎细胞培养疫苗。目前多数病毒采用异步接毒法这种接毒方式。

罗维等在适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建中发现异步接毒样品的 PCR 检测结果均为阳性，且信号都较强，说明异步接毒比同步接毒要稳定，重复性较好，不会出现接不上毒的情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，包括以下步骤：

1)将ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养20～96小时，使用胰酶消化细胞；

2)将消化后的CPB细胞转入含有5%v/v～10%v/v胎牛血清的L15培养液中，同时接种ISKNV；

3)28～32℃恒温培养接种后的鳜脑组织细胞系CPB 2d～12d，收获细胞并提取病毒核酸。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤1）中ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养时间为30h～60h。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤2）中培养液中胎牛血清的添加量为5%v/v～8%v/v。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤2）中按照MOI值为0.85～2.3接种ISKNV 。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步骤3）中恒温培养，观察CPE达80%以上时收获细胞并提取病毒核酸。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤1）中ISKNV敏感的鳜脑组织细胞系CPB传代后培养时间为20h～40h。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤2）中培养液中胎牛血清的添加量为8%～10%v/v。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤2）中按照MOI值为30～45接种ISKNV。

进一步的，上述鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV的短时间增殖方法中，步骤3）中恒温培养，观察CPE达80%以上时收获细胞并提取病毒核酸。

本发明的有益效果是：