[发明专利]一种检测体液中碱性磷酸酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种检测体液中碱性磷酸酶的方法，尤其涉及一种基于生物发光定量检测碱性磷酸酶的方法。

背景技术

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)，也称碱性磷酸酯酶，是一类可以在碱性条件下催化磷酸酯键水解的酶。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶、非组织特异性碱性磷酸酶和胎盘碱性磷酸酶。通常情况下，干细胞和结肠癌细胞中碱性磷酸酶的活性会显著升高，被当作结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标。此外，血清中碱性磷酸酯酶的升高，被称作高碱性磷酸酶血症，被认为和恶性胆管阻塞、原发性胆管硬化、原发性硬化胆管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝胆疾病密切相关。因此快速、灵敏地检测体液中的碱性磷酸酶具有重要的意义。

目前检测体液中的ALP酶主要的方法是基于酶的显色反应，其中对硝基苯磷酸二钠(pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物，在碱性条件下，可在碱性磷酸酶作用下生成对硝基苯酚。对硝基苯酚在碱性条件下，呈黄色产物，可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深，说明碱性磷酸酶检活性越高，反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。目前基于该原理已经有相关的商业化试剂盒。但该方法受到多种因素的限制，例如体液中有很多物质会干扰酶和底物之间的反应，造成该试剂盒的使用受到一定的限制。另外罗氏P800全自动生化分析仪及配套生化试剂盒和CL-7300型全自动生化分析仪顺序注射荧光法也用来测定体液中的ALP含量，但这两种方法除价格昂贵，造成分析成本比较高外，仪器较大不易携带，不能满足临床和个性化诊断的需要。

因此开发一种成本低，抗干扰能力强，灵敏度高的适合床边诊断的分析方法和相关的小型化检测设备对体液中的碱性磷酸酶的检测具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测体液中碱性磷酸酶的方法，特别是一种基于生物发光定量检测碱性磷酸酶的方法。本发明的方法具有灵敏度高、抗干扰能力强，检测仪器携带方便，适用范围广，操作简单，适合临床诊断的分析方法；同时还可以大大缩短检测时间和降低检测成本。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种检测体液中碱性磷酸酶的方法，该方法采用生物发光法对体液样本中的碱性磷酸酶含量进行检测。

本发明的检测体液中碱性磷酸酶的方法是以三磷酸腺苷作为碱性磷酸酶的底物进行催化反应，根据反应得到的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量。

本发明通过以三磷酸腺苷(ATP)作为碱性磷酸酶的底物，由于碱性磷酸酶可以高效地催化三磷酸腺苷转化为腺苷，从而抑制了基于三磷酸腺苷的生物发光反应，因此碱性磷酸酶的含量越高，其消耗的三磷酸腺苷就越多，生物发光的改变量就越大，从而得出生物发光的改变量和碱性磷酸酶的含量成正相关，进而计算得出样本中碱性磷酸酶的含量。

本发明中，所述三磷酸腺苷的浓度为1nM-100μM，优选为50μM。

本发明中，所述的检测体液中碱性磷酸酶的方法包括以下步骤：

(1)将三磷酸腺苷与碱性磷酸酶混合，震荡反应15-30min；

(2)向步骤(1)的混合液中加入生物发光试剂，用三磷酸腺苷检测仪测量生物发光值，根据所述的生物发光值的改变量计算碱性磷酸酶的含量。

本发明的步骤(1)中，所述碱性磷酸酶将三磷酸腺苷催化降解为腺苷。

本发明的步骤(2)中，所述生物发光试剂包括荧光素和荧光素酶及相关的Mg²⁺和缓冲溶液。

本发明中的生物发光试剂为现有市售产品，不作特别限定。

优选地，步骤(2)的混合液中，在三磷酸腺苷提供能量的情况下，荧光素酶催化荧光素发光，并且发光强度和ATP的含量成正比。

本发明中，步骤(1)所述震荡反应的温度为20-37℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃。

本发明中，所述方法包括在步骤(1)之前，进行碱性磷酸酶的富集。

优选地，所述富集为利用免疫磁珠进行富集。

本发明采用免疫磁珠富集碱性磷酸酶，可以从复杂的样品中将碱性磷酸酶提取出来，特异性地捕获到碱性磷酸酶，避免样品中的基质干扰，提高了检测的灵敏度和准确性。