[发明专利]一株牛支原体NADH氧化酶的单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一株牛支原体NADH氧化酶的单克隆抗体及应用。该单克隆抗体是由交瘤细胞株8B7分泌的，所述的NADH氧化酶是一种牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,简称NOX)。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,简称M.bovis)是肉牛和奶牛的重要病原微生物，是导致我国牛呼吸综合征的主要病原体，主要临床症状为肺炎，还可导致乳腺炎、关节炎、生殖道炎症、结膜炎、中耳炎等多种症状。剖检病理变化主要集中在胸腔与肺部，表现为肺和胸膜发生不同程度的粘连并有少量积液。牛支原体于1961年首次在美国从患乳房炎奶牛的牛奶中分离得到，1976年证实其是导致肺炎的重要病原体。此后，牛支原体肺炎和乳腺炎已给欧、美各国造成了巨大的经济损失(Caswell等，2010；White等，2010)。据估计，欧洲每年约有25％～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44～1.92亿欧元,其中英国每年就有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡达15.7万头。美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1.40亿美元,牛场感染率可达70％。

随着我国养牛业向规模化和集约化发展，牛养殖量大大增加，专门化程度大幅度提高，肉牛“异地育肥”已成为重要的肉牛养殖模式。长距离运输是“异地运输”的重要环节，运输应激可诱发多种重要疫病，牛支原体肺炎就是其中一种。2008年，湖北省从外地引进肉牛中流行呼吸道疾病，牛群引进后2周左右发病，表现为发热，咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。发病率为50％～100％。临床治疗周期长，效果差，病死率平均10％，可高达60％，给我国养牛业带来了巨大损失。本实验室于2008年率先确定该病为“传染性牛支原体肺炎”(石磊等，2008)。随后，不同研究群体均证实该病在全国广泛流行(胡长敏等，2009；辛九庆等，2008)。此外，近年来奶牛乳腺炎致新生犊牛爆发牛支原体肺炎的事件也频繁发生。在病原学和流行病学研究基础上，本室完成了牛支原体HB0801的基因组序列解析(GenBank登录号：CP002058)(Qi等,2012)。

牛支原体无细胞壁，对常用β内酰胺类抗生素不敏感，对其它药物如四环素、大环内脂类和氟喹酪酮类等敏感药物的耐药性也在迅速增加(Mustafa等,2013)。迄今为止，尚无有效疫苗预防该病。因此，早期诊断和治疗是控制该病的唯一方法。

目前该病的诊断方法主要有病原体分离鉴定、血清抗体检测和核酸诊断三类。牛支原体的分离和鉴定，至少需要3天时间，分离需特殊营养，菌落观察需在低倍显微镜下，支原体种的鉴定还需辅助PCR和/或测序方法；血清抗体检测只能说明牛体感染过牛支原体，在流行病学调查中有意义，但不能作为牛支原病的诊断依据。针对牛支原体的PCR和等温环介导方法灵敏度高，但前者需要特殊仪器设备和较高的实验操作技能，且都容易因污染核酸而出现假阳性。因此，临床上急需一种能检测牛支原体抗原的检测方法，获得特异性高亲合力的单克隆抗体是建立牛支原体抗原检测方法的前提和基础。当然，单克隆抗体还可在致病机理研究、治疗药物开发等方面具有广泛的用途。

虽然国外和国内先前都有报道研制成功牛支原体单克隆抗体，但单克隆抗体针对的抗原均为未知，限制了这些单克隆抗体的应用(Rasberry等，1992)。本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室的课题组对牛支原体HB0801株进行了基因组测序分析(GenBank登录号：CP002058)，结果表明，牛支原体是一种变异性极高的原核生物，针对牛支原体本地流行株表面相对保守、且免疫原性良好的蛋白抗原制备的单克隆抗体，将具有更为广阔的应用前景。本发明从该指导思想出发，克隆表达了牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,简称NOX)；以重组rNOX免疫小鼠，获得杂交瘤细胞，筛选获得一株高亲合力的单克隆抗体，经过免疫印迹和免疫荧光实验验证该抗体特异性良好，灵敏度高，并具有牛支原体检测能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体表面保守蛋白rNOX的新型单克隆抗体，该单克隆抗体是一种牛支原体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH oxidase,NOX)，由杂交瘤细胞株8B7分泌，该单克隆抗体可以特异、灵敏和稳定地识别牛支原体。

本发明的另一个目的在于提供一种在体外条件下对牛支原体NOX单克隆抗体的抗原检测方法，用于牛支原体的标记和临床检测。

本发明的技术方案如下所述：