[发明专利]枯草芽孢杆菌的高丝氨酸脱氢酶基因灭活方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的高丝氨酸脱氢酶基因灭活方法。

背景技术

赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，赖氨酸不足时会限制其它氨基酸的利用，发展赖氨酸生产对提高动物饲料利用效率具有重要的意义。工业上生产赖氨酸主要以发酵法为主，但由于生产菌株产酸水平较低，生产规模较小，生产成本较高，难以和进口产品竞争等问题，因此，选育高产赖氨酸菌种成为当务之急。

目前，基因工程上通常采用基因敲除技术而获得比原始菌株高产赖氨酸的菌株，该敲除菌主要是通过同源重组的方式获得，通过将带有高丝氨酸脱氢酶基因的质粒转化至感受态细胞，筛选而来，但该方法步骤较多。常规方法是先扩增高丝氨酸脱氢酶基因L臂，再扩增高丝氨酸脱氢酶R臂，然后将L臂和R臂连接，在L臂和R臂中间插入抗性基因，用获得的DNA片段或质粒转化至细菌，通过同源重组获得基因敲除菌株。如何开发一种简单、快速的高丝氨酸脱氢酶基因灭活方法将有利于枯草芽孢杆菌高丝氨酸脱氢酶基因的灭活，并能获得赖氨酸产量高于原始菌株的突变株。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种简单、快速的枯草芽孢杆菌的高丝氨酸脱氢酶基因灭活方法。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种枯草芽孢杆菌的高丝氨酸脱氢酶基因灭活方法，该方法包括以下步骤：

a、构建用于同源重组的PCR产物的质粒，该重组质粒由pMD18-T载体、卡纳霉素抗性基因和高丝氨酸脱氢酶基因组成，其中，该同源重组的DNA片段含有用于替代待灭活基因的高丝氨酸脱氢酶基因以及在高丝氨酸脱氢酶基因中间部位(BseP1酶切位点)插入的卡纳霉素抗性基因；

b、从重组质粒上PCR扩增高丝氨酸脱氢酶基因以及在高丝氨酸脱氢酶基因中间部位插入的卡纳霉素抗性基因，使PCR产物单链化，将所述单链PCR产物转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞，得到转化子，并筛选出阳性转化子，即高丝氨酸脱氢酶基因灭活的突变株。在本发明中，将所述单链PCR产物转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞的方法为电转化法，当然，也可采用本领域内的其它现有常规方法。

其中，位于该卡纳霉素抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列与待灭活基因两侧的侧翼序列相同，其基因序列为在高丝氨酸脱氢酶基因的BseP1酶位点插入了卡纳霉素抗性基因的基因片段。

本发明方法相对现有将高丝氨酸脱氢酶重组质粒转化枯草芽孢杆菌感受态细胞的技术，更为简单、省时。本方法直接扩增高丝氨酸脱氢酶全长基因，直接通过BseP1酶切后插入抗性基因，方法简单快速有效，且获得的突变株的赖氨酸含量要明显高于原始菌株。

附图说明

图1是枯草芽孢杆菌PA105和高丝氨酸脱氢酶基因灭活菌株的PCR电泳结果图。

其中：1:2000bp MARKER，2:5000bp MARKER，3:以枯草芽孢杆菌PA105细菌培养物为模板扩增高丝氨酸脱氢酶基因所得的PCR片段1300bp左右，4:以突变株(枯草芽孢杆菌PL13-hom::Km)细菌培养物模板扩增高丝氨酸脱氢酶基因所得的PCR片段2300bp左右。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。

实施例1枯草芽孢杆菌PA105高丝氨酸脱氢酶基因灭活

枯草芽孢杆菌PA105由本申请人所在实验中心提供，保藏编号为CCTCC：M2011328。

1、枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基：

GMI培养基:1mL10×Spizizen salts、0.1mL10％酵母粉、0.25mL20％葡萄糖、0.2mL1％水解酪蛋白、0.2mL0.25％所需氨基酸，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。

GMII培养基:1mL10×Spizizensalts、0.05mL 10％酵母粉、0.25mL20％葡萄糖、0.04mL1％水解酪蛋白、0.2mL0.25％所需氨基酸、0.05mL0.1mol/LCaCl2、1mL25mmol/LMgCl2，补充灭菌蒸馏水至总体积10mL。