[发明专利]一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药测定方法，具体涉及一种利用HPLC同时测定半夏中6种有机酸含量的方法。

背景技术

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(thunb.)Breit.的干燥块茎，别名三叶半夏，三步跳，麻芋子，地雷公，半夏为多年生草本，块茎圆球形，主要分布于重庆、四川、湖北、河南和贵州等地。性辛，温，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效，临床用于痰多咳喘、痰饮眩悸、风痰眩晕、呕吐反胃、胸脘痞闷等症，用途广泛。半夏含有多种化学成分，主要包括有机酸类、生物碱类、半夏蛋白和酚类等。有研究报道运用小鼠镇咳祛痰药理模型评价了半夏镇咳祛痰的成分与效应之间的关系，发现有机酸与镇咳祛痰作用具有相关性，对氨水引咳的小鼠模型皆具有明显的止咳作用，同时还发现半夏有机酸对体外培养的胃癌细胞有明显的抑制作用，并呈现明显的量效关系。而半夏有机酸类成分中主要包括草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。目前文献报道对半夏药材及其饮片中有机酸的测定主要采取电位滴定法，《中国药典》(2010年版)中也采用电位滴定法对半夏中总有机酸含量进行测定，以琥珀酸含量计算，进行质量控制。

电位滴定法测定半夏总有机酸的含量，结果以琥珀酸含量计，该方法只能粗略反映半夏中有机酸类成分的总量，不能反映半夏中各有机酸成分的具体情况，对含有有机酸的种类和各自含量高低无法测定出来，显然用该方法来评价半夏质量的真实性、优良性和稳定性存在缺陷，不够明确和科学。而且电位滴定法测定半夏总有机酸的方法专属性不强，易受到其他酸性物质以及操作条件的影响。目前还未见采用HPLC法对半夏药材中各种有机酸进行含量测定的文献研究。因此，建立一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法具有重要意义。本发明对半夏中的草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸进行测定，作为质量控制的指标更加明确，具体。该方法准确，简便，可以为半夏的质量控制提供参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高，专属性强的同时测定半夏提取物中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的方法，能够快速、准确的测定它们各自的含量。克服了现有电位滴定法测定半夏药材中总有机酸方法的缺陷。

本发明所述的一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法，按下列步骤进行：

(1)样品溶液制备：称取干燥的半夏药材粉末2.0g，精密称定，加入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容。精密量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH在11.5-12范围内，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱水液，再滴加磷酸调pH在2.0-2.5范围内，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶液。

(2)对照品溶液制备：分别精密称取草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对照品适量，加水溶解，制得含有草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的混合对照品溶液。

(3)高效液相色谱测定：将对照品溶液和样品溶液进行高效液相色谱测定，色谱柱为GL InterSustain-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为磷酸调节pH＝2.0的0.03mol·L^-1(NH₄)H₂PO₄缓冲液和甲醇，体积比为97∶3，流速为0.8mL·min^-1，柱温30℃，检测波长210nm，对照品溶液和样品溶液各进样20μL，采用标准曲线法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按草酸峰计算不低于3000。

本发明采用HPLC法同时测定半夏中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的含量，结果这6种有机酸在15分钟内达到基线分离，且分离度均大于1.5，理论塔板数按草酸峰计算不低于3000，6种有机酸成分在各自浓度范围内线性良好，相关系数r≥0.9999，回收率在96.80％-100.8％之间。本方法可用于半夏中6种有机酸成分的质量分析，该方法准确度和灵敏度高，重现性好。

附图说明

图1混合对照品溶液色谱图(1.草酸，2.甲酸，3.苹果酸，4.乙酸，5.柠檬酸，6.琥珀酸)

图2半夏药材提取物色谱图(1.草酸，2.甲酸，3.苹果酸，4.乙酸，5.柠檬酸，6.琥珀酸)