[发明专利]启动子优化的慢病毒基因修饰T细胞在肿瘤治疗中的应用

说明书

技术领域

本发明属于利用慢病毒技术基因修饰T及NK细胞并使之获得稳定的特异性抗肿瘤能力的一种基因修饰技术，属于第四代特异性抗肿瘤免疫治疗技术，是近年来肿瘤免疫治疗技术的一个热点，在肿瘤治疗(包括白血病)上取得了突破性进展(Lee,Kochenderfer et al.2014,Maude,Frey et al.2014)。

背景技术

恶性肿瘤是最为严重危害人类健康的疾病,每年中国大约三百万人被诊断为新发肿瘤患者，二百万人死于癌症。尽管可以通过手术、放疗、化疗进行治疗,但大多数病人不能承受治疗毒副作用和治疗效率，仍死于肿瘤的复发和转移。所以,如何清除残留的微小肿瘤组织或肿瘤细胞则是现代肿瘤免疫学有待解决的问题之一。由于癌症发生的根本原因是肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监控而进行无节制的生长，所以提高免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞将从可以根本上去除肿瘤。目前，免疫疗法是国际公认的最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大新的治疗方法。“癌症免疫疗法”被美国《科学》杂志评为2013年最大的科学突破。免疫疗法逐渐成为治疗癌症最有效的方法之一。

同西方发达国家正在澎湃发展的第四代肿瘤特异性免疫治疗技术相比，我国目前的免疫治疗还停留在第二代和第三代非特异性免疫治疗阶段。第四代免疫技术的主要技术依托是基因修饰技术，目前，我国基因修饰技术同西方发达国家相比严重滞后，缺乏可以提供基因工程病毒载体制备的服务机构及技术支持，更缺乏相关法规来指导临床的应用。令人欣喜的是，我国对肿瘤免疫治疗非常重视，也有越来越多的科研院所，企业投入人力，资金加入该邻域的研发及临床应用；但是，缺乏基因修饰手段成了制约免疫细胞治疗升级换代的首要因素。

目前国际上最流行的可以稳定整合免疫细胞的病毒载体是LENTIVIRALVECTOR(慢病毒载体体系)，已在欧美发达国家进行了大量的临床试验，是公认安全，高效基因转导系统。如前所述，以抗肿瘤TCR及CAR T技术为代表的基因修饰技术给肿瘤的治疗带来了崭新的方法学，并引发了肿瘤治疗史上的重大突破，2013年更被多家权威杂志列为年度科技突破。其所需要的基因修饰既由该基因修饰载体来完成，已经进行了大量的人体实验，其中有的实验治疗者已经平安的度过了20余年，没有发现任何毒副作用。

本发明所应用的慢病毒属于最新一代载体系统，由四个功能组分构成，最大程度地降低了其重组的可能性。在改造的慢病毒体系中，为了有效地表达目的基因，需要加入一个有效的启动子，其功能是启动目的基因在宿主细胞内表达。目前，比较流行的启动子是CMV(Human cytomegalovirus)UBC(Ubiquitin)、PGK(phosphoglycerate kinase-1)、EF1(elongation factor-1alpha)等，但它们在T及NK细胞内的表达不够持久、效率低、容易被甲基化从而失去功能。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题而提出的。本发明系统地比较了不同的启动子，并进行了优化性构建，筛选出了最适合在人类T及NK细胞内表达的MSCV启动子(鼠干细胞病毒启动子)，该启动子比较其它启动子具有高效，稳定长期表达的优越性，是一种非常有临床应用前景的基因修饰体系。另外，为了达到高效均衡地表达抗肿瘤受体(TCR)的两条链(α和β),该发明亦优化了病毒来源的2A结构，既优化地构建了Furin+SGSG+2A链接体，最大化地并均衡地表达抗肿瘤TCR的两条链，经基因修饰的T细胞可以特异性识别表达特异性抗原的肿瘤细胞，并高效率、特异性地杀伤肿瘤，实现了抗肿瘤效果的最大化。

鉴于基因修饰的T细胞表达的抗肿瘤TCR存在主要组织相容性复合体限制性(MHC)的问题，既一种抗肿瘤TCR只能应用到一类特定的人群(Morgan,Dudley et al.2006)，发明人进一步应用该启动子优化的慢病毒表达载体基因修饰T、NK细胞，使之表达CAR的结构，并证实经基因修饰的T、NK细胞可以特异性地识别表达相应肿瘤抗原的靶细胞，包括肿瘤细胞。

本发明主要包括：

1.优化慢病毒启动子，比较了MSCV，PGK，UBC等启动子在原代T细胞及NK细胞上的表达效率，实验证实MSCV启动子优化的慢病毒体系是基因修饰T、NK细胞的最佳方案(见图1-2)；

2.优化构建表达TCR两条链的2A链接体，并在T细胞表面高效表达，同时可以特异性识别并有效杀伤表达相应抗原的肿瘤细胞(见图3-6)；