[发明专利]用于使用CARS显微术分析样本的方法

说明书

公开了一种用于使用CARS显微术来分析样本(1)的方法，所述样本(1)从生物源获得。在所述方法中，使用相干反斯托克斯拉曼散射通过激光辐射激励样本(1)中的至少一个谐振点(5)而生成的谐振信号以图像产生的方式被捕获。所公开的方法包括通过使样本(1)的内在化学结构(2)经历与至少一个反应搭档(3,6)的生物正交反应来创建至少一个谐振点(5)。

技术领域

本发明涉及根据权利要求1的前序部分的用于使用CARS显微术研究从生物源获得的样本的方法。

背景技术

“非线性拉曼光谱术”被理解为指基于光在固体或气体处的非线性拉曼散射的光谱研究方法。本发明涉及基于相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的显微研究方法。

针对这种研究方法(也称为“CARS显微术”)，使用发射不同波长的光(v_P和v_S，泵浦和斯托克斯光束)的两个激光器来生成CARS光谱v_CARS:v_CARS＝2v_P-v_S,I_CARS≈(I_P)²-I_S，其中，v_S应当是可调谐的。

图2示意性地示出了CARS过渡的谱项图。如果频率差v_P-v_S匹配所研究样本中的两个分子振动状态|1>和|0>之间的频率差，则CARS信号被放大。其中这种不同的分子状态发生并且也相应地可探测到的样本的结构(通常为特征化学键)在以下被称为“谐振部位”。通常包含它们的一个或多个分子的相应结构也被称为“散射体”。

泵浦光束和斯托克斯光束同轴地组合用于显微术应用，并且被一起聚焦在相同的样本体积上。反斯托克斯辐射被发射的方向根据针对下面的如图3中示意性示出的四波混频过程的相位适应条件来确定。

用于CARS显微术的方法和设备例如从DE 10243449 A1(同时地US 7,092,086 B2)已知，其描述了一种CARS显微镜，其具有用于生成可经由显微镜光学系统同轴地指向样本的泵浦光束和斯托克斯光束的部件，并具有用于探测相应的探测光的探测器。

CARS显微术的进一步的物理原理可以从当前的参考工作收集(参见例如Xie,X.S.等在J.B.Pawley(ed.),Handbook of Biological Confocal Microscopy,3rd edition,New York,Springer,2006中的Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy)。

与传统的或共焦拉曼显微术相比，在CARS显微术中，可以特别地实现更高的探测光产量和对干扰的次生效应的更好抑制。探测光还可以更容易地与辐照光分离。

如所提到的，因为样本中的分子或者特定化学键的特征自然振动可以在CARS显微术中使用，所以其允许物种选择成像，其在原理上省掉进一步的标记和染色。利用CARS显微术，关于样本的分子结构信息可以以三维空间分辨率获得。

然而，CARS显微术总是依赖于样本中相应的谐振部位的存在。如果谐振部位不存在，或者如果针对感兴趣结构，它们的振动状态的频率差不足以与周围区分，则它们不能被探测到。另外，利用CARS显微术的已知方法，通常难以抑制非谐振背景。

皮秒激光脉冲可以例如用于操作和减少非谐振背景，但是它们需要使用相应复杂的激光器。用于减少非谐振背景的另外的可能性是所谓的“外延探测(epi-detection)”和偏振敏感探测。时间分辨方法也在该情况中使用。另一可能性是控制激励脉冲的相位。

然而，实践证明，上述方法是有点繁琐的。在特定情况下，也期望对样本中的已定义结构的选择性强调，但是这在用于CARS显微术的传统方法中是不可能的。