[发明专利]用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能干细胞的悬浮和群集

权利要求书

1.一种在动态搅动悬浮培养系统中扩增和分化多能细胞的方法，所述方法包括在平面 贴壁培养物中将多能细胞培养成聚集的细胞群集，并在动态搅动悬浮培养系统中分化所述 多能细胞群集，其中所述分化步骤包括使用Cyp26抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法增加处于所述细胞周期的G0/G1期中的细 胞百分比。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养包括包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白 的环境。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述环境还包含Rho激酶抑制剂。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞是贴壁的。

6.一种增加处于细胞周期的G0/G1期中的细胞百分比的方法，所述方法包括在包含约 0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境中在平面贴壁培养物中将多能细胞扩增成聚集的细胞 群集，将所述多能干细胞群集从所述平面贴壁培养物中转移至动态悬浮液，并在用小分子 和任选地用TCGβ家族成员补充的培养基中在所述动态悬浮液中培养所述细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述小分子为MCX并且其中所述TGFβ家族成员为 GDF-8。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述扩增包括包含Rho激酶抑制剂的环境。

9.一种将多能细胞分化成定形内胚层的方法，所述方法包括在包含约0.1%至约2%的牛 血清白蛋白的环境中在平面贴壁培养物中将多能细胞扩增成聚集的细胞群集，将所述多能 干细胞群集从所述平面贴壁培养物中转移至动态悬浮液，并在用MCX和GDF8或WNT3A以及活 化素A补充的培养基中在所述动态悬浮液中培养所述细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述扩增包括包含Rho激酶抑制剂的环境。

11.一种在动态搅拌悬浮培养系统中扩增和分化多能干细胞的方法，所述方法包括在 平面贴壁培养物中将多能干细胞扩增成聚集的细胞群集，将所述多能干细胞群集从所述平 面贴壁培养物中转移至动态悬浮液，并在动态搅动悬浮培养系统中分化所述多能细胞群 集，其中所述细胞在包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境中扩增成聚集的细胞群集。

12.根据权利要求11所述的方法，其中分化所述多能细胞群集以产生胰腺前体细胞群、 神经前体细胞群或心肌细胞前体群。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、人脐带组 织来源的细胞、孤雌生殖体、人胚胎干细胞（hES）以及羊水来源的细胞。

14.一种可移植干细胞来源的细胞产物，所述可移植干细胞来源的细胞产物包含由根 据权利要求11所述的方法制备的所述分化胰腺前体细胞群。

15.一种在动态搅动悬浮培养系统中扩增和分化多能细胞的方法，所述方法包括：

a.在包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境中在平面贴壁培养物中将所述多能细 胞扩增成聚集的细胞群集，

b.使用酶或螯合剂将所述多能细胞群集从所述平面贴壁培养物中转移至动态悬浮培 养物，

c.将所述细胞群集保持在动态搅动悬浮培养系统中，以及

d.在动态搅动悬浮培养系统中分化所述多能细胞群集以产生胰腺前体细胞群、神经 前体细胞群或心肌细胞前体群，

其中所述分化环境包括约缺氧至约环境的30%的氧范围，0.1%至约2%范围内的脂质或 它们的组合。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述干细胞群集表达CD9、SSEA4、TRA-1-60和 TRA-1-81，但是缺少对CXCR4的表达。

17.根据权利要求15所述的方法，其中用于扩增的所述环境还包含Rho激酶抑制剂。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述分化环境为约0.1%至约2%的牛血清白蛋白。