[发明专利]半乳寡糖的生产

说明书

本发明涉及半乳寡糖(GOS)的酶促制备。提供了用于由乳糖制备GOS的方法，其包括(i)使乳糖进料与固定化β‑半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)接触和(ii)允许进行GOS合成，其中所述乳糖进料是结晶乳糖的水性浆料。

本发明涉及用于制备半乳寡糖(galacto-oligosaccharide，GOS)的方法。GOS(也称为寡聚半乳糖基乳糖、寡聚半乳糖、寡聚乳糖或反式半乳寡糖(transgalactooligosaccharide，TOS))是一种重要的食品成分[1]。由于GOS具有不可消化性，因此其属于益生元组群(group of prebiotics)。益生元被定义为通过刺激结肠中有益细菌的生长和/或活性而对宿主产生有益影响的不易消化的食品成分。GOS当添加至婴儿配方乳(infant milk formula)时复制人乳之促双歧杆菌生长作用(bifidogenic effect)的能力(不仅在细菌数量方面，而且对于结肠微生物丛的代谢活性也如此)已使对其生产以及在多种食品和制药过程中应用的关注显著提高。例如，GOS存在于市售可得的产品中，例如用于婴儿和成人两者的食品，范围从婴儿配制品到用于严重疾病的食品。

顾名思义，GOS的合成通常涉及多个由β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖水解酶；EC3.2.1.23)催化的半乳糖基转移过程，β-半乳糖苷酶使用乳糖作为半乳糖基供体，使用乳糖或中间体GOS物类作为半乳糖基接受体。

潜在的机制示于方案1中。简言之，酶和半乳糖基供体(乳糖，β-D-Galp-(1，4)-β-D-Glcp)初始形成瞬时半乳糖基-酶复合物(En--Galp)并随后形成真正的共价半乳糖基-酶复合物(En-Galp)，其从该复合物释放葡萄糖分子(β-D-Glcp)。然后，另一半乳糖基接受体(乳糖β-D-Galp-(1，4)-β-D-Glcp或其他GOS物类)与该复合物在活性中心结合并一般用其非还原端(乳糖的半乳糖基部分)对该半乳糖基-酶复合物(En-Galp)进行亲核攻击，由此导致形成DP3 GOS物类，其一般表达为β-D-Galp-(1→n)-β-D-Galp-(1，4)-β-D-Glcp产物，其中n表示糖苷键的位置，其根据酶来源和所应用的反应条件可以是2、3、4或6。

方案1.通过β-半乳糖苷酶催化之乳糖通过β-1，4糖苷键的延伸的GOS合成机制的示意图。

随着反应的进行(参见方案1)，越来越多的半乳糖基部分被转移至现有的GOS物类，导致形成具有不同聚合度(degree of polymerization，DP)的GOS物类。因此，GOS一般可表达为(Gal)m-Glc(其中根据酶来源和所应用的反应条件，m通常在2至9之间变化)。除≥DP3 GOS物类之外，新的DP2物类(例如异乳糖)通常被认为是β-半乳糖苷酶的半乳糖基转移作用的初级产物。通过β-半乳糖苷酶的半乳糖基转移形成的这些新DP2物类可进一步参与形成高等DP GOS物类，因而使GOS产物谱复杂化，如下文所讨论。

尽管酶β-半乳糖苷酶在食品和乳制品工业中具有多种应用，但是酶的中度稳定性是阻碍生物催化剂在工业规模上进行一般性实施的限制之一。探索其作为催化剂的全部潜能的研究已产生多种用于酶稳定化的合适策略。例如，已通过多种方法(例如物理吸附、捕获和共价结合方法)将酶固定在不同的支持物上。还已表明，固定化对降低β-半乳糖苷酶的生产抑制具有有利作用。此外，酶固定化有利于酶的可重复使用性和GOS合成过程的持续操作。

众所周知，β-半乳糖苷酶催化的GOS合成在动力学上受到控制[2]。这意味着，在某个时间点形成的半乳寡糖实际量在很大程度上取决于乳糖和/或GOS的期望合成反应相对于不期望水解反应的相对速率。这进而不仅依赖于乳糖浓度而且还依赖于所形成的GOS物类，并且再者还依赖于酶与由合成和水解产生的产物的相互作用。

因此，多种GOS物类不仅可用作进一步GOS合成的接受体而且还可用作水解底物。水解反应一般将在反应后期占优势，此时已经过GOS浓度的峰值并且反应混合物中主要底物乳糖的浓度降低至较低值。另一方面，当积累越来越多的产物时还可发生生产抑制，导致GOS合成或GOS水解被抑制。