[发明专利]融合多肽和疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及新的免疫原性多肽以及它们在疫苗组合物中的用途。本发明还涉及核酸、载体和表达所述多肽的细胞以及它们的用途。更具体而言，本发明的多肽包含免疫原性结构域和来源于B5R基因的细胞膜定址(addressing)结构域。本发明特别适合于生产用于非人动物的疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种(vaccinating)以抵抗PCV2感染。

背景技术

猪环状病毒(porcinecircovirus，PCV)最初被鉴定为猪肾细胞培养物(PK15ATCCCCL-33)的污染物。PCV病毒粒子(virion)已被表征为具有约1.76kb的单链环状DNA的二十面体无包膜病毒。PCV被分类在环状病毒科(Circoviridaefamily)的环状病毒属(genusCircovirus)，环状病毒属还由其它动物环状病毒构成，例如鹦鹉喙羽病病毒(psittacinebeak-featherdiseasevirus)、鹅环状病毒、金丝雀环状病毒和鸽环状病毒。已识别出两种PCV基因型。PK15细胞来源的PCV已被认为对于猪是非致病性的，并被指定为PCV1型(PCV1)。另一方面，公认PCV2型(PCV2)是涉及数种猪疾病的主要感染因子。PCV2相关疾病对全球的猪生产者造成了重大经济损失。PCV2相关疾病在WO2007/076520中有所描述，包括例如断奶后多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性表皮炎、坏死性淋巴结炎以及先天性震颤。西欧于2000年、中欧于2003年具体报道了PCV2亚型A(PCV2A)和PCV2亚型B(PCV2B)的出现。最近，在2008年报道了野猪中的类似变化。

目前开发的PCV2疫苗(如(Merial)、CircoFLEX(BoehringerlngelheimVetmedica)或)要么为灭活PCV2疫苗、要么为亚单位疫苗。关于灭活PCV2疫苗，目前的PCV2毒株亚型A或亚型B存在一些缺点。特别是，只能以低滴度生产PCV2病毒，通常小于10⁵TCID50病毒颗粒/毫升。另外，这些病毒不能在组织培养物和永久感染细胞系中维持。关于PCV2亚单位疫苗，它们通常使用纯化的重组PCV2衣壳蛋白，该蛋白通过在杆状病毒系统中表达PCV2的ORF2基因而产生。就此而言，EP1741785中已报道了由PCV2分离株(isolate)Imp1011的ORF2编码的蛋白。WO2010/061000中已报道了由PCV2分离株PCV2Rm的ORF2编码的蛋白。EP1816200中已报道了由PCV2分离株412的ORF2编码的蛋白。EP1036180或EP2225367中已报道了由另外的PCV2分离株的ORF2编码的另一蛋白。

但是，这些天然衣壳蛋白的表达效率和免疫原性不佳，并且在疫苗接种的动物中不是总能提供所需水平的免疫保护。特别是，ORF2蛋白包含核定位序列，导致蛋白在细胞的细胞核中表达。这样的细胞内定位不便于该蛋白的提取或纯化，并且还可能阻止或减少在动物体内表达ORF2蛋白的DNA疫苗或载体疫苗的有效性。

WO2010/068969提出了通过使用外来分泌信号肽序列来改进ORF2的表达谱，以表达可溶形式的ORF2抗原。在这一申请中，提出了将ORF2与分泌信号或与细胞膜信号融合，并在构建体中包含切割位点，从而使得能够以可溶形式释放可溶性ORF2。该申请提出了关于可能的候选分泌肽的很长的预言性列表。但是，该申请并未包含表明通过改进ORF2的表达谱可获得有效的或改善的表达/免疫原性的任何实验数据。没有公开允许实现有效免疫(immunization)的构建体。

本发明提出了用于表达抗原性多肽的新的改善的构建体。本发明公开了专门适于抗原性多肽在细胞表面的改善表达的融合产物，尤其是使用病毒表达载体(如猪痘(swinepox)病毒)在细胞表面进行的改善表达。

本发明表明，通过使用B5R来源的定址信号在被感染/转导的细胞表面表达抗原性多肽，实现了改善的免疫应答，引起了有效的保护。通过在动物体内将抗原呈现在细胞表面，本发明的疫苗最有效地将抗原递送和暴露至免疫系统，特别是递送和暴露至免疫细胞(如淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞)。通过将抗原呈现在细胞表面，本发明提供了处于活性构象的免疫原，从而引发强有力的保护性免疫应答。本发明可应用于任何抗原性多肽，特别是病毒抗原。

发明内容