[发明专利]血液凝固检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及测定血液或血浆凝固能力的血液凝固检测方法。

背景技术

血液凝固活性是用于得到指标的重要项目，所述指标用于筛选外源性凝血因子不足或监测肝功能的异常和口服给药的抗凝血剂治疗。

这种血液凝固检测主要使用PT(凝血酶原时间)测定法、APTT(活化部分促凝血酶原激酶时间)测定法、血纤蛋白原检测等。通过使用医院里的大型分析设备进行这些测定和检测。当使用这些方法中的PT测定法和APTT测定进行检测时，将蛋白(血栓调节蛋白或鞣花酸)和凝固血液的钙离子大体上混合作为血浆中的凝固反应触发物，测定从混合开始到凝固完成的时间(凝固点)，并通过比较测得时间与标准血浆结果估测滞后时间。

这种测定内源性/外源性血液凝固途径的血液凝固活性的PT法目前在国际上已经标准化(PT-INR)并且被认为是高重复性和高可靠性的检测项目。例如，首先，搅拌阻力方案作为物理的实施PT法的方法是可行的。搅拌阻力方案是这样的方法：将样品(标本)与活化剂一起引入，并从用叶片搅拌样品和活化剂时搅拌阻力的上升测定血液凝固时间。

此外，作为实施PT测定法的方法，光散射法是可行的(参见专利文献1、2和3)。光散射法是这样的方法：在测定容器中将作为靶标的血浆与含有用于促进凝固活化的成分的试剂混合，使光进入容器，并通过测定入射光的散射光的量的改变测定血液凝固时间。从散射光的量得到血液凝固时间的方法包括直接使用散射光的量的方法，使用散射光的量的导数值的方法和得到直到散射光的量达到预定值的时间的方法(参见专利文献1)。

以上搅拌阻力方案和光散射法目前在许多情况下常用于血液凝固的检测。除它们之外，已经开发了热传导方案、晶体振荡器方案、使用磁珠的聚集测定法(参见专利文献4)等。

此外，本发明的发明人已提出一种通过使用SPR(表面等离子体共振)测定法测定流速来检测凝固活性方法，所述测定法使用具有微流路的芯片。在该检测中，首先，在即将测定之前制备通过与凝固活化剂(鞣花酸和氯化钙)混合而完全活化的血浆样品。然后，将血浆样品引入预先用缓冲溶液填充的流路以将血浆在流路中流动的流速转化为凝固时间(参见专利文献5)。使用这样的微流路的流速测定具有可以使用少量样品快速测定凝固活性的优点。

相关技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利公开号06-027115

专利文献2：日本专利公开号2009-506332

专利文献3：日本专利公开号09-266798

专利文献4：日本专利公开号09-502800

专利文献5：日本专利公开号2011-232137

专利文献6：日本专利公开号2010-133727

非专利文献

非专利文献1：MasayukiNAYA等，“使用单片棱镜尖的高敏感度SPR传感器”，FUJIFILMRESEARCH&DEVELOPMENT，NO.50，pp.51-54，2005

发明内容

本发明要解决的问题

然而，以上基于流速的血液凝固检测不能进行精确的检测。在血液凝固检测中，在通过使用凝固活化剂在血浆中产生凝固活性物质后，测定归因于粘度增加的流速变化，所述粘度增加由主要从血纤蛋白形成的凝固物质引起。出于这一原因，不溶性蛋白非特异性吸附于用于测定的测定容器而污染其表面。特别是，血纤蛋白是具有分子量大到允许多个蛋白残基之间同时相互作用的蛋白，因此具有比其他蛋白更高的非特异性吸附能力。

如上描述的，在血液凝固检测中，由于用于检测的流路内部被污染，该污染将改变流速。由污染所致的流速改变造成大的测定误差，导致不能得到精确的测定值。为了解决这一问题，例如，可以清洗流路内部以总是保持流路内部一致清洁。这样的清洗技术包括，例如，用蛋白移除溶液例如碱性清洗溶液填充流路内部或浸渍每个微流路芯片的方法，以及作为物理技术的使用清洗溶液喷射、超声清洗等的组合的方法(参见专利文献6)。

然而，由于在清洗期间不能进行检测，当例如连续进行多个检测时，检测通过量大幅下降。此外，通过测定流速来进行血液凝固检测的技术被设计为测定依赖于粘度的流速。出于这一原因，当测定具有相同凝固能力但具有不同粘度的样品时，不可能正确区分这些凝固能力。

如上所述，使用微流路的血液凝固检测具有可以通过使用少量样品快速测定凝固活性的优点。然而，使用流速将产生不能进行精确检测的问题。