[发明专利]采用CRISPR/Cas系统的植物基因组的工程改造

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/790,694的优先权。

有关联邦资助的研究的声明

本发明得到政府的支持，在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的GM834720和国家自然基金会(NationalScienceFoundation)授予的DBI0923827的资助下完成。政府对本发明拥有某些权利。

技术领域

本发明涉及用于在植物中基因靶向的材料和方法，具体而言，涉及采用CRISPR/Cas系统进行基因靶向的方法。

背景

允许在活细胞中精确修饰DNA序列的技术对于基础和应用研究而言均具有价值。精确基因组修饰–靶向诱变或基因靶向(GT)–依赖靶细胞的DNA-修复机制。对于靶向诱变，序列-特异性核酸酶(SSN)介导的DNA双链断裂(DSB)通常被易于出错的非同源末端连接(NHEJ)通路修复，导致断裂位点处的突变。另一方面，如果供体分子与SSN共同递送，后续DSB可能会刺激所述断裂位点附近的序列与供体分子上存在的序列之间的同源重组(HR)。因此，供体分子携带的任何经修饰的序列将被稳定地整合进入基因组(称为GT)。意于在植物中进行GT的尝试常常受困于极低的HR频率。大多数情况下，供体DNA分子通过NHEJ不合理地整合。该过程的发生与同源“臂”的大小无关；使同源长度增加至约22kb，导致GT的增强不显著(Thykjaer等，PlantMolBiol，35:523-530，1997)。然而，伴随SSN引入DSB能够通过HR大幅提高GT频率(Shukla等，Nature459:437-441，2009；和Townsend等，Nature459:442-445，2009)。

发明内容

本发明部分基于如下发现：可采用成簇且规律间隔的短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats)/CRISPR-相关的(CRISPR/Cas)系统来进行植物基因组工程改造。所述CRISPR/Cas系统为在基因组DNA中的选定位点处产生修饰提供了相对简单、有效的手段。CRISPR/Cas系统可用于产生靶向的DSB或单链断裂，并且能够用于(不限于)：靶向诱变、基因靶向、基因替换、靶向缺失、靶向倒位、靶向易位、靶向插入，和通过共表达多重靶向RNA导向的单细胞中的多重DSB进行的多重基因组修饰。该技术可用于提高植物中功能性遗传学研究的速度，以及用于工程改造出具有改善的特点的植物，所述改善特点包括，营养质量增强、抗病和抗应激性提高，以及市场价值化合物的产量提高。