[发明专利]变体因子VIII多肽及其产生和使用方法

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15号提交的美国临时申请No.61/789,112的权益，其通过提述完整并入本文。

发明领域

本文中提供了人凝固因子VIII变体和编码这类变体的多核苷酸，包含和表达这类变体的载体和宿主细胞，获得这类变体的方法，使用这类变体的方法，变体的组合物，和与其相关的另外的发明特征。

发明背景

血液凝固是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白凝块形成的过程。通常参与被常称为凝固“级联反应”的血液组分是不具有酶活性的蛋白(原酶或酶原)，通过激活剂的作用使其转化为蛋白水解酶，所述激活剂本身常常是激活的凝固因子。对凝固级联反应关键性的一种肽是因子VIII或FVIII。事实上，最常见的遗传性凝血病症血友病A是由因子VIII中的缺陷或结构性缺陷导致的。因子VIII的生物化学允许针对凝固的快速打开/关闭转换。它作为无活性的辅因子循环，通过凝血酶(凝固级联反应的倒数第二个酶)被活化为FVIIIa。FVIIIa与FIXa、膜或磷脂(PL)表面和Ca⁺²一起参与一种短寿命的酶复合物(FXase)以将FX转化成FXa。FVIIIa作为FXase复合物中的参与者的主要功能是突出地增多FXa，由此允许凝血酶生成。因子VIII由～186kb基因编码，该基因由26个外显子组成(Thompson,SeminarsinThrombosisandHemostasis,29:11-22(2003)(参考文献11和16-18))。该基因的mRNA的翻译继之以19个氨基酸的信号序列的除去，产生2332个氨基酸的成熟蛋白质。该蛋白由6个主要域组成，其从氨基末端为：A1、A2、B、A3、C1和C2。涉及活化的另外的短酸性区域a1、a2和a3分别散布在A1和A2、A2和B、和B和A3域之间。这一2332个氨基酸的主要翻译产物被加工成异二聚体，其由异质性重链(含有完整的A1,a1A2,a2域和多种长度的B域)和同质性80kD轻链(含有a3、A3、C1和C2域)组成。B域的异质性来自分泌期间的蛋白水解。

因子VIII到因子VIIIa的活化一般经由通过凝血酶对原辅因子(procofactor)的蛋白水解而发生。凝血酶识别限定沿因子VIII肽链的凝血酶切割位点的特定氨基酸区域。因子VIII具有3个凝血酶切割位点。对其他凝血酶底物的检查揭示了可被凝血酶容纳的多个残基。尽管在这些凝血酶切割位点内的氨基酸可在一定程度上变化，但某些氨基酸比之其他氨基酸在这些切割位点内要更常见得多，且某些氨基酸残基引起凝血酶对该肽的更有效的切割。(参见例如Newell-Caito等,“P3-P3’ResiduesflankingScissileBondsinFactorVIIIModulateRatesofSubstrateCleavageandProfactorActivationbyThrombin,”Biochemistry51:3451-59(2012)；Gallwitz等,“TheExtendedCleavageSpecificityofHumanThrombin,”PLoSONE7:e31756(2012))。因子VIII中的3个凝血酶切割位点之一位于或接近a1-A2接合处，其位于或接近成熟野生型人因子VIII肽的氨基酸位置370-375处。

在切割后，活性因子VIIIa是包含A1亚基、A2亚基和A3C1C2亚基的异三聚体。该异三聚体由在亚基彼此相互作用所在区域处的亚基之间的静电和疏水性相互作用两者支持，所述区域称为“域界面”。已知该异三聚体包含至少A1-A2和A2-A3域界面。(参见例如美国专利No.8,338,571(2008年7月25日提交)(2012年12月25日授权))。