[发明专利]遗传和表观遗传调节蛋白至特定基因组基因座的RNA引导的靶向

说明书

优先权的声明

本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请系列第61/799,647号、2013年6月21日提交的美国专利申请系列第61/838,178号、2013年6月21日提交的美国专利申请系列第61/838,148号和2013年12月26日提交的美国专利申请系列第61/921,007号的权益。前述专利申请系列号的完整内容在此通过引用并入。

联邦资助的研究或开发

本发明是在由美国国家卫生研究院授予的基金第DP1GM105378号和由国防部的国防高等研究计划署(DARPA)授予的W911NF-11-2-0056下借助政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及用于将遗传和表观遗传调节蛋白，例如，转录激活物、组蛋白修饰酶、DNA甲基化修饰剂RNA引导靶向至特定基因组基因座的方法和组合物。

背景

被称为CRISPR/Cas系统的成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)和CRISPR相关(cas)基因被不同细菌和古细菌(archaea)用来介导抵抗病毒和其它外来核酸的防御。这些系统使用小RNA来以序列特异性方式检测和沉默外来核酸。

已描述了3个类型的CRISPR/Cas系统(Makarova等，Nat.Rev.Microbiol.9,467(2011)；Makarova等，Biol.Direct1,7(2006)；Makarova等，Biol.Direct6,38(2011))。最近的工作已显示II型CRISPR/Cas系统可被工程化来通过使用与DNA靶位点具有互补性的单一“引导RNA”和Cas9核酸酶在体外将靶向双链DNA断裂导向特定序列(Jinek等，Science2012；337:816–821)。该可靶向的基于Cas9的系统也在培养的人细胞中(Mali等，Science.2013年2月15日；339(6121):823-6；Cong等，Science.2013年2月15日；339(6121):819-23)以及在斑马鱼中在体内起作用(Hwang和Fu等，NatBiotechnol.2013年3月；31(3):227-9)以诱导至内源基因内的靶向改变。

概述

本发明至少部分基于融合蛋白的开发，所述融合蛋白包括与其核酸酶活性已通过突变灭活的Cas9核酸酶(也称为“dCas9”)融合的异源功能性结构域(例如，转录激活结构域)。虽然公布的研究已使用引导RNA将具有催化活性但失活的Cas9核酸酶蛋白靶向特定基因组基因座，但还没有工作改造该系统来适用于招募另外的效应子结构域。该工作还提供了导致靶基因的表达水平的升高(而非降低)的RNA引导的过程的首次例证。

另外，本公开还提供了多重gRNA可用于将多种dCas9-VP64融合物带至单个启动子，从而导致转录的协同激活的首次例证。

因此，在第一方面，本发明提供包含连接于异源功能性结构域(HFD)的无催化活性的CRISPR相关9(dCas9)蛋白的融合蛋白，所述异源功能性结构域修饰基因表达、组蛋白或DNA，例如转录激活结构域、转录阻遏物(例如，沉默子诸如异染色质蛋白1(HP1)，例如HP1α或HP1β，或转录抑制结构域，例如，Krueppel相关盒(KRAB)结构域、ERF抑制结构域(ERD)或mSin3A相互作用结构域(SID))、修饰DNA的甲基化状态的酶(例如，DNA甲基转移酶(DNMT)或10-11易位(TET)蛋白，例如，也称为Tet甲基胞嘧啶双加氧酶1的TET1)或修饰组蛋白亚单位的酶(例如，组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)或组蛋白脱甲基酶)。在一些实施方案中，所述异源功能性结构域是转录激活结构域，例如，来自VP64或NF-κBp65的转录激活结构域；催化DNA脱甲基化的酶，例如，TET；或组蛋白修饰(例如，LSD1、组蛋白甲基转移酶、HDAC或HAT)或转录沉默结构域，例如，来自异染色质蛋白1(HP1)，例如，HP1α或HP1β；或生物系链，例如CRISPR/Cas亚型Ypest蛋白4(Csy4)、MS2或λN蛋白。

在一些实施方案中，无催化活性的Cas9蛋白来自化脓性链球菌(S.pyogenes)。

在一些实施方案中，无催化活性的Cas9蛋白在D10、E762、H983或D986；以及在H840或N863，例如在D10和H840处包含突变，例如D10A或D10N和H840A或H840N或H840Y。