[发明专利]采用寡核苷酸介导的基因修复提高靶向基因修饰的效率的方法和组合物

权利要求书

1.一种用于将基因修复寡核碱基(GRON)介导的突变引入细胞中的靶脱氧核糖核酸(DNA)序列中的方法，所述方法包括：

将成簇的规律间隔的短回文重复复合物(CRISPR复合物)和GRON递送至所述细胞中，其中所述GRON包括以下特征中的一项或多项：

所述GRON长度大于55个碱基，所述GRON任选地包含两个或更多个突变位点以用于引入至所述靶DNA中；

所述GRON包含一个或多个无碱基核苷酸；

所述GRON包含一个或多个8’氧代dA和/或8’氧代dG核苷酸；

所述GRON包含在其3’端处的反向碱基；

所述GRON包含在其5’或3’端处的一个或多个2’-O-甲基核苷酸；

所述GRON包含在其5’端处的一个或多个2’-O-甲基RNA核苷酸；

所述GRON包含在其5’端处的至少两个2’-O-甲基RNA核苷酸；

所述GRON包含嵌入染料；

所述GRON包含5’末端帽；

所述GRON包含选自由以下组成的组的主链修饰：硫代磷酸酯修饰、膦酸甲酯修饰、锁核酸(LNA)修饰、O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修饰、二PS修饰以及肽核酸(PNA)修饰；

所述GRON包含一个或多个链内交联；

所述GRON包含共价连接至其的一种或多种荧光染料；以及

所述GRON包含增加杂交能量的一个或多个碱基。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述GRON包括2、3、4、5或更多项所述特征。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括使用核苷酸多聚体合成所述GRON的全部或一部分。

4.如权利要求1-3中的一项所述的方法，其中所述靶脱氧核糖核酸(DNA)序列是在植物细胞基因组内。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述植物细胞是选自由以下组成的组的物种：芥花、向日葵、玉米、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、苜蓿、高粱、西红柿、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、土豆、胡萝卜、莴苣、洋葱、大豆属、甘蔗、豌豆、鹰嘴豆、蚕豆、扁豆、萝卜、芜菁甘蓝、球芽甘蓝、羽扇豆、花椰菜、羽衣甘蓝、菜豆、杨树、松树、桉树、葡萄、柑橘、燕麦、草皮和牧草、亚麻、油菜、芥菜、黄瓜、牵牛花、香脂、辣椒、茄子、万寿菊、莲花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鸢尾、百合以及产坚果植物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述大豆属是大豆。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述豌豆是紫花豌豆。

8.如权利要求4所述的方法，其中所述植物细胞是选自黑小麦的物种。

9.如权利要求4所述的方法，其中所述植物细胞是选自黑麦的物种。

10.如权利要求4中的一项所述的方法，其中所述植物细胞是转基因的。

11.如权利要求4中的一项所述的方法，其中所述靶DNA序列是所述植物细胞的内源基因。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是选自由以下组成的组的一种或多种细胞：植物细胞、动物细胞、细菌细胞、酵母细胞以及真菌细胞。

13.一种用于从根据权利要求4-11中任一项所述的植物细胞再生具有通过所述GRON引入的突变的植物的方法。

14.如权利要求12所述的方法，其还包括从所述植物采集种子。