[发明专利]由多能干细胞生成肝细胞和胆管细胞的方法

权利要求书

1.一种从人诱导多能干细胞群产生肝细胞和/或胆管细胞的方法，所述方法包括：

a)使作为单层培养或形成为胚状体的所述人诱导多能干细胞与诱导培养基接触4天-8天以提供诱导的内胚层细胞群，所述诱导培养基包括ActA和Wnt/β-连环蛋白激动剂；

b)使所述诱导的内胚层细胞群与nodal激动剂接触1-4天，以提供延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群；

c)将所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层细胞群与特化培养基接触4-10天，以获得扩增的成肝细胞种群；所述特化培养基包括选自FGF2、FGF4和FGF10的FGF激动剂和选自BMP4、BMP2和BMP7的BMP4激动剂；

d)用包括HGF、Dex和OSM的成熟培养基培养所述扩增的成肝细胞种群10天至14天；

e)通过酶处理和人工解离解离步骤d)获得的所述成肝细胞种群；

f)生成所述解离的所述成肝细胞种群的聚集体，以及用包括HGF、Dex和OSM的成熟培养基培养所述聚集体；

以及

g)使用cAMP类似物培养步骤f)获得的所述聚集体6天至10天。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述延长的nodal激动剂处理的诱导的内胚层种群包括至少80％、85％、90％、或95％的CXCR4和CKIT阳性细胞和/或至少70％、75％、或80％的SOX17⁺细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述FGF激动剂是FGF2。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述成肝细胞种群的聚集体包括至少70％、80％、85％或90％的白蛋白阳性细胞。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述cAMP类似物选自8-溴腺苷-3’5”-环单磷酸、丁酰-cAMP、腺苷3’,5’-环单硫代磷酸、SP-cAMP、8-溴腺苷-3’,5’-环单硫代磷酸和Sp-8-Br-cAMP。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，使用Wnt激动剂进一步培养所述成肝细胞种群的聚集体6天至10天。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述Wnt/β-连环蛋白激动剂为Wnt3a。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤g)期间，所述成肝细胞种群的聚集体进一步与如下中的一种接触：

a)Wnt/β-连环蛋白激动剂和TGFβ拮抗剂，以促进白蛋白+/HNF4+祖细胞种群的扩增；或

b)Wnt拮抗剂和Mek/Erk拮抗剂，以促进CYP酶的表达。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述TGFβ拮抗剂为SB431542，所述Wnt拮抗剂为XAV939，以及所述Mek/Erk拮抗剂为PD0325901。

10.根据权利要求1或2中所述的方法，其中，所述成熟培养基进一步包括促进肝细胞谱系特化的Notch拮抗剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法产生功能性肝细胞；

其中，与包括肝祖细胞和/或胆管祖细胞的细胞群的细胞相比，所述功能性肝细胞中，

选自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、NAT2和UGT1A1组成的组的至少一种蛋白质的表达和/或活性获得增加；和/或

选自由ALB、CPS1、G6P、TDO、CYP7A1、CYP3A7、CYP1A2、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6、NAT2和UGT1A1组成的组的至少一种基因的表达获得增加。