[发明专利]一种可被4’磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列及其用于固定蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列及其用于固定蛋白质的方法。

背景技术

固定化蛋白(酶)呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求，在生物医药、食品、生物分析及生物学的基础研究领域具有广泛的应用。传统的蛋白(酶)固定方法包括包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。包埋法制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的蛋白(酶)活力回收。交联法利用游离蛋白(酶)的氨基酸残基与双官能团或多功能团交联剂反应而被固定化，可获得单位浓度较高的固定化蛋白(酶)。吸附法包括物理吸附和离子结合法，工艺简便及条件温和是其显著特点。目前上述的各种酶固定化方法存在各自的不足，包埋法中高分子凝胶或半透膜的分子尺寸选择性不利于大分子底物与产物的扩散，交联法因为较激烈的共价反应而使蛋白(酶)活力损失较大，吸附法中固定的蛋白(酶)易受反应介质pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。共价结合法因蛋白(酶)分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性，是目前研究最为活跃的一类蛋白(酶)固定化方法，然而非定向的共价固定由于蛋白(酶)在固体介质表面的不均匀分布，常导致蛋白(酶)活性损失较大。目前已开发的蛋白(酶)定向固定化方法，如利用蛋白(酶)与相应抗体的特异性作用、蛋白(酶)与相应配基的特异性相互作用等，操作流程复杂，效率较低，这些不足限制了固定化蛋白(酶)的广泛应用，成为急待解决的主要问题。目前现有的蛋白质(酶)固定化技术操作流程复杂，缺乏特异性。开发简便、温和、适用的固定化方法等是目前固定化蛋白(酶)研究的重要方向，也是目前研究热点之一。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列。

本发明的另一目的提供基于上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列固定蛋白质的方法。

本发明的上述目的通过如下方案予以实现：一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，优选为如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示的大肠杆菌酰基载体蛋白(ACP)基因序列或如核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽基因中的一种。

上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，所编码的具有生物活性的短肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

一种重组表达载体，包含上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，用于将目的蛋白与其融合表达。

上述的重组表达载体的具体制备步骤为：将可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列与目的基因重组融合构建到表达载体获得；所述的表达载体优选为表达载体pET系列载体。

一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌的重组表达系统；具体为：将上述重组表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，培养至OD600为0.5～0.7，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于30℃诱导蛋白表达10h；5000g，10min，4℃离心收集菌体，获得表达融合目标蛋白的大肠杆菌。

一种基于上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列固定蛋白质的方法，由上述的大肠杆菌的重组表达系统，获得包含目标蛋白的融合蛋白，经酶AcpS或Sfp催化进行4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰，然后进行固定化，实现固定目标蛋白。

所述的固定化为在固定化缓冲液中按1mg：0.2ml的比例将重组蛋白与SulfoLink coupling resin(Thermo Scientific)混合，30℃温浴1h，实现蛋白固化。

所述的固定化缓冲液为50mmol Tris HCl，5mmol EDTA-Na，pH 8.5。

本发明提供的蛋白(酶)固定化技术应用可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的蛋白质(短肽)作为融合标签，与目标蛋白融合表达，利用4’-磷酸泛酰巯基乙胺的巯基(-SH)与固体介质上的活性基团特异性反应，形成牢固的共价键，将目标蛋白稳定地固定到固体介质上，且目标蛋白在固体介质表面分布均匀，活性高；同时进行固定化反应时条件温和，不会导致蛋白质变性，整个固定化反应可在1小时内完成，效率极高。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：