[发明专利]粪便取样提取黔金丝猴基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种粪便取样提取黔金丝猴基因组DNA的方法。

背景技术

黔金丝猴（Rhinopithecus brelichi）隶属于灵长目（Primates）猴科（Cercopithecidae）仰鼻猴属（Rhinopithecus），是传说中美猴王孙悟空的原形，外形惹人喜爱，具有相当观赏价值。在我国特有的三种金丝猴中，黔金丝猴数量最少，栖息地最狭窄，是珍稀保护动物，被誉为“世界的独生子”，仅存800只左右分布于贵州省梵净山自然保护区约340平方公里范围内，比国宝大熊猫还要稀少。早在1989年就列为我国一级重点保护动物；1996年列入濒危动物红皮书濒危（E级）^[1]。保护黔金丝猴既是保护自然环境的重要内容之一，也与人类自身生存息息相关，对黔金丝猴遗传变异水平和群体遗传结构的深刻认识，能制定合理、科学、有效的保护措施，这对于极度濒危的黔金丝猴来说是迫在眉睫。但是，由于野外黔金丝猴采集血样困难，保护遗传学研究难以全面深入展开。

非损伤性取样（non-invasive sampling）是在不捕捉和不干扰动物正常活动情况下，收集动物脱落毛发、粪便、口腔黏膜细胞、尿液等样品，从中获取DNA的方法。其中粪便含有成千上万的肠壁脱落细胞，是最具潜力的DNA资源^[2,3]。1992年Matthial H?ss等^[4]首先用粪便做材料对棕熊线粒体控制区141 bp的片段进行分析，标志着粪便DNA分析技术建立；1997年，Jane Z Reed等^[5]首次提出分子粪便学（molecular scatology）概念，提倡运用分子粪便学技术，以PCR为基础，有效开展个体识别、性别鉴定、野外种群遗传结构分析和种群大小预测等研究。粪便提取DNA的可靠性已经在许多文献中证实，丁波等^[6]通过实验证实对粪便DNA进行特异性扩增是可靠的；M A J Frantzen等^[7]在对不同方法保存粪便的效果进行讨论时指出，超过60%的粪便DNA样品可以获得与血液DNA一致的结果； Ernest H B等^[8]运用12个微卫星标记对美洲狮粪便DNA进行分析的结果也表明，粪便DNA可以获得与肌肉样品一致的基因型结果。张志敏^[9]通过粪便取样对亚洲黑熊脑源性神经营养因子全长基因分析证实粪便取样的可靠性。

目前关于黔金丝猴的报道仅几篇，主要集中在个体水平上黔金丝猴形态习性、生态环境和人工饲养等方面描述[13,14]；国内杨眸宇等（2002年）用放射免疫法对黔金丝猴血清TEST与E2进行测定[15]；李明等（2004年）报道了从线粒体DNA细胞色素b（402bp）和12SrRNA（387bp）基因片段推断四种金丝猴间种系发生关系，认为金丝猴是一个独立属，川金丝猴、滇金丝猴和越南金丝猴可能是从黔金丝猴中分化出来的种[16]；Yang M et al（2009年）评价了黔金丝猴的生殖参数，认为黔金丝猴比川金丝猴和滇金丝猴面临更高灭绝风险[17]；但是，由于采集血样的限制，相关研究进展比较缓慢。

Pierre Taberlet等[18]曾指出，用粪便样品作为实验材料，通过多次重复实验，结果的可靠性可达到99%，同时为排除污染，提取过程中设置阴性对照十分必要。本文参照问现在中方法，但对方法中酚氯仿抽屉去除蛋白质的方法改进为94℃加热10min让蛋白质变性[10,11]，操作简便、试剂成本低、所提取的DNA纯度高。因此，该方法在分子粪便学中值得推广。在粪便DNA提取和PCR扩增过程中均设置阴性对照，甚至对抽提阴性对照进行PCR扩增，排除实验过程中人为操作造成污染的可能性；同时以毛发做阳性对照和多次重复实验，监测粪便中各种杂质和微生物可能造成的污染，彻底排除污染干扰。为获得准确可靠的实验结果，作者对采集的粪便样品做3次重复抽提DNA；每次粪便抽提做十管（包括阴性对照），平均而言有6～8管可以得到有效扩增产物（60～80%），这个比例已经相当高；对每次提取的粪便基因组DNA做三次重复PCR扩增，选取其中六个扩增良好的PCR产物和两次毛发DNA扩增产物电泳，其中3个粪便和一个毛发扩增产物用于测序，获得相同结果，充分证明本实验的准确性和可靠性。