[发明专利]一种荞麦耐盐突变体的诱变筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农作物耐盐突变体的诱变筛选方法，具体涉及一种荞麦耐盐突变体的诱变筛选方法。

背景技术

荞麦是一种适于在冷凉气候下生长的短季蓼科作物，生育期短、耐寒、耐贫瘠、适应性广、营养丰富，荞麦的栽培种主要有甜养(Common Buckwheat)和苦荞(Tartary Buckwheat)两个种。荞麦主要种植在西北、华北地区，这些地区盐碱地较多，再则干旱土壤返盐严重，给荞麦的生产带来了很大的困难。因此，研究开发荞麦耐盐突变体的诱变筛选方法，从而扩大了荞麦的多型性，进一步选育开发耐盐荞麦新品种应用到荞麦生产中具有重要的意义和应用价值。

化学诱变剂EMS(ethyl methyl sulfone，甲基磺酸乙酯)是一种烷化诱变剂，已广泛应用于农作物诱变育种，可以使鸟嘌呤发生烷基化，在DNA复制中烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基由G：C替换为A：T，从而发生点突变；EMS处理发生突变的频率较高，且多为显性突变，有利于突变体的筛选。

目前，现有技术中有利用⁶⁰Co-γ射线辐照诱发苦荞突变体筛选高黄酮含量的种质资源的文献报道，并且辐照诱变常使DNA发生断裂，DNA损伤较大。但是仍然没有荞麦耐盐突变体诱变筛选的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种诱变频率高、筛选效率高、操作成本低、性状稳定荞麦耐盐突变体的诱变筛选方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种荞麦耐盐突变体的诱变筛选方法，包括以下步骤：

(1)预处理荞麦种子：挑选籽粒饱满的荞麦种子，先用自来水洗净，接着用去离子水或蒸馏水振荡洗涤3～5h，吸水纸吸干；然后放入0.3％～0.4％甲基磺酸乙酯(EMS)溶液中浸摇10～12h，捞出荞麦种子，最后用100mmol/L，pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗2～3遍，去离子水或蒸馏水冲洗2～3遍，备用；

(2)筛选荞麦突变体：将步骤(1)中备用的荞麦种子接种含有5μmol/L 1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)或20μmol/L 1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的MS固体培养基上培养，筛选出对乙烯(ETH)不敏感的荞麦突变体；ETH能够抑制植物茎的伸长、使茎失去负向地性、促进茎横向生长和增粗，这就是植物对ETH特有的“三重反应”。ETH生物合成的第一前体为蛋氨酸(methionine，Met)，而其直接前体为ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，1-氨基环丙烷-1-羧酸)，蛋氨酸经过蛋氨酸循环，生成MTA(5′-methylthioribose，5′-甲硫基腺苷)和ACC，前者通过循环再生成蛋氨酸，而ACC则在ACC氧化酶催化下氧化生成ETH。若培养基中加入ETH的直接前体ACC，则有利于ETH的快速生成，在添加ACC的培养基上野生型荞麦幼苗矮小，茎粗短；而突变体荞麦幼苗较高，茎细长，对ETH不敏感；

(3)筛选荞麦耐盐突变体：将步骤(2)中筛选的对乙烯不敏感的荞麦突变体栽培于盐度为0.4％～0.6％的盐碱地中，筛选耐盐植株并收取种子；收取的荞麦种子再次播种于盐度0.4％～0.6％盐碱地，筛选性状稳定的耐盐突变体，收取种子。

进一步，步骤(1)中，挑选籽粒饱满的荞麦种子，先用自来水洗净，接着用去离子水或蒸馏水振荡洗涤3h，吸水纸吸干；然后放入0.4％甲基磺酸乙酯溶液中浸摇10h，捞出荞麦种子，最后用100mmol/L，pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗2遍，去离子水或蒸馏水冲洗3遍。

进一步，步骤(2)中，所述培养条件是昼夜温度为16～26℃，光照时间10～12h，光照强度800μmol·m^-2·s^-1。

本发明之荞麦耐盐突变体的诱变筛选方法，通过EMS诱变容易得到突变体，并且点突变对DNA损伤较小，同时结合利用ETH的直接前体ACC筛选相结合来筛选荞麦耐盐突变体，诱变频率高，目标明确，筛选效率高，可达10％～20％，操作成本低，获得的突变体性状稳定。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

试剂配制：

1、0.4％EMS溶液配制：取2g EMS，加入50mL 70％乙醇溶解，去离子水定容至500mL。