[发明专利]用于抗体亲和力成熟筛选的细胞株及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药及抗体工程领域，具体而言，涉及一种用于抗体亲和力成熟筛选的细胞株及其使用方法

背景技术

抗体的亲和力进化系统是抗体工程和大分子生物制药行业都十分关心的重要技术，在抗体的亲和力进化筛选过程中，对目标抗体的展示，是基础的步骤，常用的体外展示系统包括如噬菌体展示系统、酵母展示系统或细菌展示系统，近年来，基于哺乳动物细胞的展示系统同样得到了很大的发展，相比其他展示系统，哺乳动物展示系统在蛋白的折叠，翻译后修饰以及密码子偏好等方面有很多的优势，体细胞突变(SHM，somatic hypermutation)结合胞嘧啶脱氨酶诱导激活(AID，activation-induced cytidine deaminase)技术，能够通过诱导胞嘧啶变为尿嘧啶，使蛋白的氨基酸序列变化，从而改善抗体亲和力，目前，已有报道利用AID诱导的体细胞高频突变原理在不同的细胞系中(293T、H1299等)建立了各种抗体亲和力成熟体系，然而这些系统耗时都比较长，而且抗体亲和力成熟效率不够高。主要体现在如下几点，

(1)这两个细胞生长速度偏慢(倍增时间约为22个小时)，而且对外源的转染载体耐受性不是很强(例如，用lipo2000转染293T后有相当一部分细胞死亡)，同时，经流式分选后存活率也较低；

(2)以两个细胞为基础的亲和力成熟体系的抗体亲和成熟过程，往往需要进行8轮以上的亲和力成熟过程才能得到高亲和力的抗体，由于生长缓慢且存活率较低，每轮进化所需要的时间更长，也导致了实验效率低下的结果。

综上，哺乳动物抗体进化系统还有大的提升空间，需要一种稳定高效的抗体亲和力成熟系统。

CHO细胞是抗体表达中常用的哺乳动物细胞，在治疗性抗体的表达中应用最为广泛，该细胞生长速度快(倍增时间大约16个小时)，耐受性强，并且生产的抗体具有同人源抗体相同或者类似的修饰，所以，选择CHO细胞为基础，结合重组酶介导的盒式替换技术(recombinase-mediated cassette exchange，RMCE)，有望建立更高效率且更简便的抗体亲和力成熟系统。

发明内容

本发明涉及一种利用重组酶介导的盒式替换(RMCE)技术建立的只含有单拷贝重组替换位点的用于目标抗体亲和力成熟筛选的CHO细胞系PuroR-14，所述PuroR-14细胞保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，编号CGMCC No.9717，保藏日期2014年10月9日，分类命名：CHO-FRT-Puro-loxP，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述的PuroR-14细胞重组替换位点含有一个puromycin抗性基因，该基因前端含有一个CMV启动子，两边分别加上了FRT和loxP序列形成一个FRT-puromycin-loxP结构。在重组酶Flp和Cre共同作用下该位点能够与同样含有FTR和loxP位点的抗体展示基因(FRT-Ab-TM-loxP)相互替换，替换进入的抗体基因在FRT前端的CMV启动子做用下转录、翻译，从而将抗体展示到细胞表面。

优选的，所述的替换抗体为单链抗体，替换的抗体基因不包含启动子。只有替换成功的抗体基因才能在CMV启动子的作用下转录表达，故每一个细胞中只有一个抗体基因表达，排除了多基因同时表达的影响。

本发明还涉及一种使用所述PuroR-14细胞系对目标抗体进行亲和力成熟筛选的方法，所述方法包括如下步骤，

(1)构建含有FTR和loxP位点的目标抗体展示基因，

(2)将所述的目标抗体展示基因替换所述PuroR-14细胞的重组替换位点FRT-puromycin-loxP，

(3)通过体细胞高频突变(SHM，somatic hypermutation)和流式分选，经1～8轮分选，对所述抗体进行亲和力成熟筛选。

优选的，所述的目标抗体为单链抗体，目标抗体展示基因不包含启动子。

优选的，步骤(3)所述的分选轮数为5轮。

优选的，通过在所述替换了目标抗体展示基因的PuroR-14细胞中转染胞嘧啶脱氨酶诱导激活(AID，activation-induced cytidine deaminase)所述体细胞高频突变(SHM，somatic hypermutation)。

附图说明