[发明专利]烟粉虱C型溶菌酶Btlys-c基因及所编码蛋白的制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域。本发明涉及一种烟粉虱溶菌酶(Lysozyme)基因及其所编码蛋白的应用，尤其涉及一种烟粉虱溶菌酶(Lysozyme)的体外重组表达技术、活性重组蛋白的分离纯化以及对微生物抗菌作用研究。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶。由Flemming于1922年发现的，它广泛存在于真核生物和原核生物中,能切断肽聚糖中的N-已酰葡萄糖胺和N-已酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键，引起细胞裂解。根据溶菌酶的一级结构、分子量和生物来源，可以将溶菌酶分为6种类型，即：噬菌体T4溶菌酶(phage-type)、植物溶菌酶(plant-type)、微生物溶菌酶(bacteria-type)和3种动物型溶菌酶，即溶菌酶C型(chicken-lysozyme type)、I型(invertebrate-type)和G型(goose-type)。其中，G型溶菌酶主要存在于脊椎动物中，I型溶菌酶只存在于无脊椎动物中，而C型溶菌酶则是唯一同时存在于脊椎动物和无脊椎动物中的类型，也是目前研究得最广泛、最透彻的类型。溶菌酶作为一种天然安全的食品防腐剂，受到许多国家和组织的青睐。早在二十世纪七十年代，欧洲国家已开始将溶菌酶用于保存婴儿食品。溶菌酶加入乳中具有类似于凝乳酶的作用，可以降解酪蛋白，使牛乳人乳化。此外，溶菌酶也可用于花生酱、面条、面包、蛋糕等食品的防腐。

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)已成为一种世界性的入侵性灾害性昆虫，在世界各地暴发成灾，造成惨重的损失。该虫不仅大量取食植物汁液，导致植物枯萎，而且传播多种植物病毒，是重要的病毒传播媒介，常导致植物病毒病大流行，使作物严重减产或绝收。溶菌酶在传毒媒介昆虫烟粉虱中的研究，有利于更好的揭示其在免疫反应以及传播植物病毒中的作用及其工作机制，同时也为开发和筛选抗菌药物提供依据。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种烟粉虱C型溶菌酶Btlys-c基因及所编码蛋白的制备与应用。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种烟粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供了所述烟粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提供了利用前述烟粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因制备具有抗菌活性的重组蛋白的方法，是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。

本发明进一步提供了前述蛋白在制备抗菌类制剂、免疫增强剂或饲料添加剂中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明所提供的烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因及其编码的核苷酸序列，使其能够应用在大肠杆菌中表达新的蛋白、编码序列。所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行抑菌实验的结果表明：重组的烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因原核表达的重组蛋白具有抗革兰氏阳性菌的能力。进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法生产，在开发抗菌类药物、食品保鲜剂和饲料添加剂等方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为基于ML法构建的不同生物c型溶菌酶系统进化树。

图2为IPTG诱导的pET28a-Btlysc-BL21和纯化的重组烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。1：未诱导pET28a-Btlysc-BL21菌株；Lane 2：1mM IPTG诱导的pET28a-Btlysc-BL21菌株；3：纯化重组蛋白；M：蛋白Marker。

图3为烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)重组蛋白对枯草芽孢杆菌的抗菌作用图。

图4为烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)重组蛋白对大肠杆菌的抗菌作用图。

具体实施方案

本发明的烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

由该烟粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。