[发明专利]一株肿瘤抑制基因p63单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤抑制基因p63单克隆抗体及其应用。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞表面抗原p63分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中p63的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

p63分子在结构上与p53有高度同源性，具有三个相似的功能域：N端转录激活区、核心DNA结合区、C端寡聚体化区，其中寡聚体化区含特有的SAM结构是p53所不具有的。P63曾经被称为p51、KET、p40、p73L、CUSP等。基因定位于3号染色体3q27~3q29，全长包含有15个外显子和两个不同的启动子，而p53只有一个启动子。p63的两启动子中由上游1号内含子的启动子所引发mRNA的不同剪切，会产生3种p63异构体，称为TAp63，包括TAp63A、TAp63B和TAp63C，其功能类似p53，能够反式激活p53靶基因的转录并诱导细胞凋亡。而位于下游3号内含子的启动子所引发p63 mRNA，则是一类缺乏酸性N端反式激活区的截短异构体p63，称为△Np63，包括△Np63A、△Np63B和△Np63C，其丧失反式激活p53靶基因以及诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡的功能，即以显性失活的方式抑制TAp63和p53。研究证明，DNA损伤诱导的p53的凋亡途径需要p63和p73的参与。研究分析，p63在胚胎时期，多种上皮和器官发育需要p63蛋白，p63在肌上皮细胞中表达，且作用优于SMA，在肌纤维母细胞中不表达。

p63蛋白分子量为63kDa左右，选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。鉴于p63分子在肿瘤病理研究中的重要性，已有不同的抗体制备用于不同免疫学方法。公开号为CN103196731A的发明专利“用于鉴别乳腺肌上皮病变的多重染色试剂及检测方法”即描述了一种将CK8/18、即用型钙调蛋白、即用型p63、肌动蛋白HHF-35等多种单克隆抗体组合使用，以免疫组化方式鉴别乳腺肌上皮病变。公开号为CN102924594的发明专利“抗肿瘤蛋白p63单克隆抗体及其用途” 中应用p63单克隆抗体为一抗，通过与九种细胞系的蛋白裂解液进行杂交、对前列腺癌组织进行免疫组化检测、OriGene蛋白芯片检测p63的特异性、Western blot验证蛋白芯片杂交等试验，结果显示该p63抗体能与p63蛋白特异性结合，且与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p63蛋白免疫检测的特异性和可靠性。其所使用的p63单克隆抗体编号为2B10，根据p63基因的ORF全序列设计引物进行PCR扩增，在表达载体Pcmv6-Entry重组进行表达，以重组蛋白作为免疫原制备而来。目前在肿瘤诊断中使用最多的p63抗体为克隆号4A4抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好，亲和力高的p63单克隆抗体及其应用，该抗体能特异结合p63重组抗原和天然抗原。提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的应用。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明对在普通和急性淋巴细胞白血病中淋巴细胞核表达的p63分子，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，改善其表达行为，且便于纯化，在重组蛋白的N端和C端分别融合有大肠杆菌果胶酶的PelB信号肽及组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-30a-scfv中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组p63筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为1.92×10⁹。免疫印记（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组的p63蛋白以及表达p63分子的肿瘤细胞。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

1．一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系分泌。

2．所述的单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组p63抗原蛋白。