[发明专利]一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1及其分离方法

说明书

本发明公开了一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1及其分离方法，通过将种子用酒精、氯化汞处理后，接种于牛肉膏蛋白胨培养得到内生菌，用液体LB发酵菌种，将菌液接种于三丁酸甘油酯固体培养基培养，选取透明圈的菌种接种于液体LB培养基发酵，取发酵液离心分离过滤后，将滤液用三丁酸甘油酯固体培养基培养，筛选得到菌株PC1。菌株PC1平板划线得到单菌落，外观呈白色，生长初期表明湿润光滑，随后边缘出现褶皱并变干；革兰氏染色呈阳性，在电子显微镜下观察菌体呈杆状。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1及其分离方法。

背景技术

黄连木(Pistacia chinensis Bunge)又名楷木、黄楝、药木等，系漆树科黄连木属落叶乔木。黄连木籽含油49.3％，不饱和脂肪酸高达82.4％，是一种优良的野生油料资源，特别是生产生物柴油的理想木本油料。

植物内生菌(endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌、细菌或放线菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状。植物内生菌广泛存在于已研究过的所有植物中，已在农业、医药和环境保护等方面有着重大应用价值。但至今未见有关于黄连木内生菌的报道。

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是一类能在水-油界面催化甘油三酯水解，而且在非水相介质中可催化酯合成反应的酶。脂肪酶普遍存在于动植物和微生物体内，但微生物源脂肪酶具有更宽的反应pH、适宜温度范围和更强的底物专一性和立体选择性，因而在酶学理论研究和实际应用中具有更加突出的地位。

发明内容

本发明旨在提供一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1及其分离方法，通过对其中产脂肪酶的菌株进行的选育，得到优势菌株，并对其酶学性进行研究。

本发明通过以下技术方案实现：

一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2014年10月9日；保藏编号为：CCTCC M 2014461。

所述的黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1脂肪酶的核苷酸全长序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的PC1菌株平板划线得到单菌落，外观呈白色，生长初期表明湿润光滑，随后边缘出现褶皱并变干；革兰氏染色呈阳性，在电子显微镜下观察菌体呈杆状。

一种黄连木种子产脂肪酶内生菌PC1及其分离方法，具体通过以下步骤完成：

1)选取新鲜健康的黄连木果实，物理去除坚硬的果皮后，从中挑选出完好无损的种子在至少20倍体积的75％酒精中浸泡10min，0.1％氯化汞中浸泡10min，用无菌水清洗5次，每次1min；

2)将5枚经消毒的黄连木种子放入无菌研钵中，加入500μL无菌水研磨成糊状，加入无菌水稀释至5mL，取100μL稀释液接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，在28℃条件下培养3～7天，得到内生细菌，平板划线纯化后4℃穿刺保存；

3)将获得的菌株接种于5mL液体LB，28℃，150rpm培养过夜，取2μL菌液点于三丁酸甘油酯固体培养基，48h后选取菌落周围有明显透明圈的菌株，再次接种于5mL液体LB培养基中，28℃，150rpm震荡发酵48h；

4)取1mL发酵液于10000rpm离心1min后，将上清液过滤，取滤液于打好孔的三丁酸甘油酯固体培养基的孔内，28℃培养48h后依据透明圈的直径大小，筛选得到一株产脂肪酶的优势菌株PC1。

所述的牛肉膏蛋白胨培养基为：牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，pH 7.4～7.6。