[发明专利]一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种合成丙谷二肽的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和现代化的分离技术的丙谷二肽生物合成方法，具体是一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用。

背景技术

N(2)-L-丙氨酞-L-谷氨酸胺属于氨基酸的衍生物，简称丙谷二肽，主要用于人体保健行业，是人体含量最丰富的氨基酸谷氨酰胺的理想替代品。

由于谷氨酰胺极为重要的生理功能和药理作用，使其在肠外营养中的应用受到人们普遍的重视。但是由于它的溶解度低，而且溶液中不稳定，在加热灭菌的条件下，生成有毒的焦谷酸和氨，所以商品氨基酸制剂中都不含有谷氨酰胺。只有将其转化为稳定的衍生物才能对人体起作用。

相对于谷氨酰胺而言，丙谷二肽的溶解度是谷氨酸胺的20倍，在储存和加热灭菌中也很稳定，可直接制备成输液制剂用于临床。丙谷二肽进入人体后即迅速分解成谷氨酰胺而发挥作用。研究证明，丙谷二肽在体内很快被分解为其组成氨基酸，半衰期很短，血液中只能检测到少量的二肽，仅有微量的二肽从尿液中排出，说明丙谷二肽可有效的被利用而且不会在血液中积聚，避免了可能产生的药理及生理性损害。健康人体长期静脉滴注丙谷二肽没有任何副作用及不良反应，不影响正常的肾功能。

CN101659691A和CN1786019A公开了一种丙谷二肽的化学合成和工业化生产方法(如下路线)，但是该方法反应合成路线长，环境污染大，工艺成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶。

本发明第二个目的是提供一种编码所述催化合成丙谷二肽的生物酶的核苷酸序列。

本发明第三个目的是提供一种催化合成丙谷二肽的生物酶的制备方法。

本发明第四个目的是提供一种所述生物酶催化丙谷二肽的生物合成的应用，进一步提供一种所述生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法

本发明提供的丙谷二肽的生物合成采用生物酶法催化一步合成丙谷二肽；本发明利用毕氏酵母酶高效转化谷氨酰胺生成丙谷二肽，并采用现代化的先进分离技术，使丙谷二肽的工业化生产成本大大降低。

本发明的技术方案如下：

一种催化丙谷二肽生物合成的生物酶，所述生物酶为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

根据本发明所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株。

根据本发明所述催化丙谷二肽的生物合成的生物酶，所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。

本发明还提供一种编码所述的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供还一种所述的生物酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)首先构建丙谷二肽生物酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；

(2)将阳性克隆挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中，培养，最后经发酵，得到催化合成丙谷二肽用的生物酶。

本发明进一步提供一种所述的生物酶催化丙谷二肽的生物合成的方法，包括如下步骤：

(1)把L-丙氨酸甲酯盐酸盐溶于水中；

(2)将L-谷氨酰胺加入水中，降温至5-15℃,用碱调pH至8.5-9.5，形成反应体系；

(3)将所述的生物酶加入到L-谷氨酰胺的反应体系中,并将(1)中配好的L-丙氨酸甲酯水溶液加入所述反应体系中，滴加碱水，pH保持在8.5-9.5；

(4)pH不变时，反应结束，加热反应体系，升温至60-100℃，使生物酶失活，过滤除生物酶；

(5)所得滤液除盐后，减压蒸馏至固体析出；

(6)经离心分离后，得丙谷二肽粗品；

(7)用甲醇和水精制，得丙谷二肽产品。

根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(5)中所得滤液经纳滤除盐后，减压蒸馏至固体析出。

根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(6)中用过滤离心机进行离心分离，得丙谷二肽粗品。

根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(2)中pH为9.0-9.3

根据本发明所述的丙谷二肽的生物合成方法，优选的是，所述步骤(1)中所得到L-丙氨酸甲酯盐酸盐的水溶液的质量浓度为30-60％。