[发明专利]脐带组织块冻存方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种脐带冻存方法。

背景技术

脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，有两条动脉和一条静脉，在血管和内壁之间含有疏松的胶状物质(称为华通氏胶)，该胶状物质里含有丰富的脐带间充质干细胞。

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称为“万用细胞”，适用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的种子细胞。

干细胞是一类未分化未成熟的细胞，其细胞表面的抗原表达很微弱，患者自身的免疫系统对这种未分化细胞的识别能力很低，无法判断它们的属性，从而避免了器官移植引起的免疫排斥反应及过敏反应等，使同种异体移植干细胞非常安全。由于脐带间充质干细胞因其来源广泛，易获得，对机体没有任何损伤，并具有间充质干细胞的所有特性，日益受到人们的关注，越来越多的人开始储存脐带间充质干细胞以备将来不时之需。

脐带组织在4℃冰箱里保存时间最多为10天，而超过10天后再培养脐带组织细胞，则细胞生长困难。

发明内容

本发明是要解决目前脐带组织保存时间短，容易导致脐带组织细胞死亡的问题，提供一种脐带组织块冻存方法。

本发明脐带组织块冻存方法，按以下步骤进行：

一、组织块的处理：

在无菌工作台内，将脐带通过体积百分浓度75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1～2mm³的块状；

二、组织块的冷冻：

向组织块中加入DMEM，DMEM的体积为组织块体积的二分之一，重悬组织块后加入与DMEM等体积的预冷冻存液，然后按每管1mL分装到冻存管中，采用程控降温仪降温，具体为：先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-5℃，接着以21℃/min的速度降至-54℃，再以10℃/min的速度升温至-21℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃过夜保存，待细菌检测，微生物检测和病毒检测均为阴性后转入液氮中长期保存，即完成脐带组织块的冻存。

本发明的优势：

(1)本发明是先将剥离后的华通式胶剪碎至1mm³大小，这种处理后再加入遇冷的冻存液，有利于冻存保护剂渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出；所以冷冻时能有效地防止组织细胞内冰晶的生成。

(2)本发明使用剪碎至1mm³大小的华通式胶组织块，在复苏后有利于清洗，复苏过程较简单，不需要再次手动剪碎华通式胶，清洗2次后可直接进行接种培养，对细胞影响较小，并且通过组织冻存实验证明，解冻后组织块在培养瓶内直接接种贴壁存活率在98％以上，细胞生长较好，并且对冻存组织块培养后的细胞进行分化成骨实验，分化功能较强。

(3)本发明方法可应用于新生儿出生后脐带的保存，脐带组织块可以在液氮深低温环境长期保存并具有新鲜组织类似的活性、生长能力和分化能力，根据需要可复苏、扩增后应用到未来疾病的治疗中。

组织块加入冷冻保存液后，通过程控降温仪降温，梯度降温冻存组织块，根据组织冻存过程中的升温及降温的规律设定相应的冻存速率，能最大限度的保护组织细胞不受损伤。通过本发明采用的脐带组织冻存方法能够保存脐带组织20年以上，根据使用情况进行复苏组织块，用于细胞培养。

附图说明

图1为冷冻前脐带组织块的P1代细胞生长状态；图2为解冻复苏后P1代细胞生长状态；图3为脐带组织块冻存前后的生长曲线；图4为冻存组织块复苏后培养的细胞分化成骨细胞照片；图5为冻存前的新鲜组织细胞分化成骨细胞照片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式脐带组织块冻存方法，按以下步骤进行：

一、组织块的处理：

在无菌工作台内，将脐带通过体积百分浓度75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1～2mm³的块状；

二、组织块的冷冻：