[发明专利]高效诱导成体细胞表观重编程的试剂盒及其方法

权利要求书

1.高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）诱导剂的制备；

（2）成体细胞的制备；

（3）成体细胞诱导；

（4）特性鉴定；

所述步骤（1）中诱导剂为天然淡水鱼卵母细胞提取物；

所述步骤（2）中成体细胞为动物皮肤组织成纤维细胞；

所述步骤（3）中诱导细胞培养基为DMEM培养基；

所述步骤（4）中诱导细胞特性鉴定包括细胞形态学、免疫细胞化学、细胞生物学和分子生物学方法。

2.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，步骤（1）中诱导剂的制备方法为：选取卵黄充满卵母细胞时相的鲫鱼一条，置于75%的酒精溶液中浸泡30分钟，取出后采用头部后侧击打的方法将鲫鱼致死，然后用手术刀从泄殖腔处划开鲫鱼腹部，无菌取出鱼卵后置于50ml无菌离心管中，随即投入液氮中5分钟，然后置于4℃条件下解冻（大约10分钟），反复3次后按体积比为1:1的比例加入生理盐水，在研钵中充分研磨后1000rpm离心10分钟，然后在3000rpm离心10分钟后取上清，200目分子筛过滤，考马斯亮蓝法测定卵母细胞提取物总蛋白浓度，稀释成100mg/ml浓度后4℃保存备用。

3.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤（2）中成体细胞的制备方法包括成纤维细胞的分离和培养两个环节，其方法分别为：（1）成纤维细胞的分离方法：用碘酒对鼠腹部皮肤组织进行旋转消毒，用手术剪剪去毛发，用手术刀剪取2~3cm²的皮肤，置于含有100U/ml（U为国际单位）氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液（Phosphatebufferedsolution，PBS，1LpH为7.4的PBS包括8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄）中，漂洗3次后，剪弃脂肪组织和结缔组织，将皮肤剪成约1mm³左右的组织块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM培养基中，置于4℃过夜，按照1:1的比例加入含有0.25%胰酶和0.02%的乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA）的PBS消化液，置于180rpm、37℃空气摇床20min，加入血清终止反应，1000rpm离心10min收集细胞；（2）成纤维细胞的培养方法为：用DMEM培养基将分离的细胞洗脱2次后，用含有15%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为每毫升约2～4×10⁵个，然后将细胞浓度调整后的细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂,、90%湿度条件下培养，每两天更换一次DMEM培养基，培养48小时后，可见成纤维细胞基本铺满整个培养皿底部。

4.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤（3）中成体细胞诱导方法为：将步骤（2）中的细胞进行传代培养，当传至第四代且细胞达到80%的细胞融合时，添加步骤（1）中制备的卵母细胞提取物，培养基与卵母细胞提取物的比例为100:1，诱导培养条件与步骤（2）中成纤维细胞的培养条件相同，诱导培养时间为12小时。

5.采用权利要求1所述高效诱导成体细胞表观重编程方法，其特征在于，所述步骤（4）中诱导细胞特性鉴定包括的细胞形态学观察方法为：将步骤（3）中诱导12小时的成体细胞置于电子显微镜下观察。