[发明专利]一种鳗弧菌快速检测系统的制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种鳗弧菌快速检测系统的制备与应用。

背景技术

鳗弧菌(Vibrioanguillarum)是目前在水产养殖业中具有极大危害的革兰氏阴性杆菌，能够感染包括海水鱼和淡水鱼在内的多种鱼类。该菌在世界不少国家和地区都引起了不同程度的病害爆发，近年来给我国水产养殖业造成了极大的危害。

建立鳗弧菌快速、简单、准确的检测方法，对水产养殖品种鳗弧菌病害控制具有重要的意义。目前，传统的检测方法，是对病原微生物富集，根据菌落形态特征和生理生化特征或结合16SrDNA测序来判定病原种类。此外，免疫学检验技术被广泛的应用到病原微生物的检测中。包括细菌凝集实验、免疫扩散实验、免疫荧光技术、免疫印迹技术、酶联免疫吸附技术(ELISA)等。部分研究工作者采用免疫学检验方法对鳗弧菌进行检测，建立了鳗弧菌免疫组化检验方法、(间接)酶联免疫吸附法(ELISA)等检测方法。近几年，有人报道了以聚合酶链反应(PCR)或环介导等温扩增技术(LAMP)对鳗弧菌特异性基因进行检测。

传统的细菌学生理生化鉴定方法费时繁琐，而一般的免疫酶试验、免疫荧光法及ELISA等方法虽然可以用于鳗弧菌的检测，但其操作程序较复杂、检测相对费时费力。PCR技术简便、快速、敏感性高，但对仪器设备及操作技能均要求较高，在水产养殖的基层单位难以大面积推广，LAMP技术虽然不需要特殊仪器设备，但操作时易出现假阳性。

20世纪90年代初，胶体金免疫层析技术(GICA)逐渐发展起来。该方法是一种以胶体金为标记物的快速免疫结合分析技术，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、肉眼判读、稳定性高等优点。相比较传统的几种鳗弧菌的检测方式，胶体金免疫技术在检测时间以及操作简便性上占了极大的优势。但是，胶体金免疫技术需要借助特异性良好、灵敏度良好且适用于制备金标抗体的抗体作为制备基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鳗弧菌快速检测系统的制备与应用。

在本发明的第一方面，提供一种用于检测鳗弧菌的测试板，其包括固相载体，以及：(1)包被于金标垫的金标抗体，其是特异性抗鳗弧菌的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO:C201477的杂交瘤细胞株产生；和(2)包被于检测线的抗体，其是特异性抗鳗弧菌的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCNO:C201478的杂交瘤细胞株产生。

在一个优选例中，所述的测试板包括：固相载体(支撑板)，以及位于固相载体上的：样品垫，金标垫，分析膜，吸水垫；所述的分析膜上设置检测线和质控线。

在另一优选例中，所述的质控线上标记与鳗弧菌抗体免疫源相同的羊抗鼠第二抗体。

在另一优选例中，所述的固相载体是PVC塑料板。

在另一优选例中，所述的分析膜为硝酸纤维素膜。

在另一优选例中，所述的测试板的固相载体上，所述的样品垫，金标垫，分析膜，吸水垫是有序排列的，使得样品在加样于样品垫后，依次流经金标垫、分析膜、吸水垫。

在另一优选例中，所述测试板上各组件的叠放顺序为：固相载体置于最底层，其上黏贴有分析膜；分析膜两端分别放置胶体金结合垫和吸水纸，胶体金结合垫和吸水纸均与分析膜重合3±1mm；胶体金结合垫的另一端放置样品垫，样品垫与胶体金结合垫重合3±1mm。

在另一优选例中，所述吸水垫为滤纸纤维。

在另一优选例中，金标抗体以0.3±0.1mg/mL的量均匀涂布于玻璃纤维素膜、聚酯膜或滤纸纤维，获得金标垫；

包被于检测线的抗体以1±0.2mg/mL的浓度、以2±0.3μL/cm喷涂于硝酸纤维素膜上预定的检测线位置。

在本发明的另一方面，提供所述的测试板的用途，用于检测鳗弧菌，或用于制备检测鳗弧菌的试剂盒。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测鳗弧菌的检测试剂盒，其中包括所述的用于检测鳗弧菌的测试板。

在本发明的另一方面，提供特异性识别鳗弧菌的单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCCNO:C201477的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；和/或其是由保藏号为CCTCCNO:C201478的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供产生特异性识别鳗弧菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCCNO:C201477；和/或其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCCNO:C201478。