[发明专利]一种牦牛胃溶菌酶的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牦牛胃溶菌酶的分离方法。 

背景技术

溶菌酶是一种碱性蛋白质，其广泛分布于动物、植物和微生物中，在哺乳动物的血浆、气管、肠道、胃、肾和肝等组织细胞中均有所表达。溶菌酶通过破坏肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，导致细胞壁结构改变，从而使细菌溶解。溶菌酶由于具有抗菌性，并且无毒、副作用，可作为潜在的抗生素替代品运用于食品、生物工程、医疗和畜禽饲料等领域。从家畜疾病控制方面考虑，溶菌酶作为添加剂而使用于饲料中，可有效防治家畜腹泻，同时为其提供营养和肠道保护，从而减少家畜的腹泻导致的死亡，提高其出栏率。 

牦牛作为分布于高寒地区的反刍动物，是青藏高原地区最重要的家畜。由于其与内陆地区动物生存环境间的差异，造就了牦牛自身的遗传特异性和对环境的独特适应性。但迄今为止，未见关于分离纯化牦牛胃溶菌酶的文献报道。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种牦牛皱胃溶菌酶的分离纯化方法。 

本发明一种牦牛胃溶菌酶的分离纯化方法，包括如下步骤： 

(1)匀浆：取牦牛皱胃粘膜组织，捣碎，加入粘膜组织2倍(v/w)的醋酸铵溶液，匀浆，离心，分离上清液和沉淀，再在沉淀中再加入沉淀2倍重量(w/w)的醋酸铵溶液，离心，合并上清液，即为匀浆液；其中，醋酸铵溶液的浓度为10mM； 

(2)粗纯：调节匀浆液的pH至4，离心，取上清液，在沸水浴中加热2min，待温度降至室温，再调pH至5，离心，得上清，即为粗純液； 

(3)CM-Sepharose FF柱层析：采用浓度为10mM的醋酸铵溶液平衡CM-Sepharose FF柱，取步骤(2)的粗纯液上样，用浓度为10mM的醋酸铵洗脱杂蛋白，再用浓度为10mM～300mM的醋酸铵溶液线性梯度洗脱，根据洗脱图谱，收集第二个峰对应的溶液，即为层析液； 

(4)Sephadex G-75柱层析：采用浓度为0.2％(v/v)醋酸溶液平衡Sephadex G-75柱，取步骤(3)的层析液上样，用浓度为0.2％(v/v)的醋酸溶液洗脱，根据洗脱图谱，收集最后一个峰对应的溶液，即得牦牛胃溶菌酶溶液； 

(5)冻干，即得牦牛胃溶菌酶。 

步骤(1)和步骤(2)中，所述离心采用的离心力为27000g，离心时间为15min。 

步骤(2)中，第一次调pH采用冰醋酸，第二次调pH采用氨水。 

步骤(3)中，洗脱的速率为1ml/min。 

步骤(3)中，所述线性梯度洗脱时，洗脱液的总体积为20CV。 

CV，表示柱体积。 

步骤(4)中，洗脱的速率为0.2ml/min。 

步骤(4)中，先在层析柱上滴加1ml浓度为0.2％的醋酸溶液，再洗脱。 

本发明还提供了前述方法制备的牦牛胃溶菌酶，及其在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。 

采用本发明方法可以从牦牛胃黏膜组织中分离得到纯品牦牛皱胃溶菌酶，其酶活高达29,268U/mg，在较宽的pH范围和离子强度范围内均有活性，有较好的热稳定性能，对胃蛋白酶有抗性，应用范围广，具有商业应用价值，还具有抑菌作用，可以作为抗菌药物使用，还可以作为添加剂而用于饲料中，防治家畜腹泻。同时，本发明方法得率高，操作简便，工业应用前景良好。 

附图说明

图1牦牛胃溶菌酶CM-Sepharose FF离子交换层析； 

图2牦牛胃溶菌酶Sephadex G-75凝胶过滤； 

图3纯化产物SDS-PAGE电泳图； 

图4纯化产物抑菌效果； 

图5pH对牦牛胃溶菌酶活性的影响； 

图6离子强度对酶活性的影响； 

图7离子强度和pH对酶活性的影响； 

图8温度对酶活性的影响； 

图9牦牛胃溶菌酶活性随时间的变化。 

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

实验材料和试剂： 

实验材料