[发明专利]一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合成方法

说明书

技术领域：

本发明涉及巯基的荧光标记技术领域，具体涉及一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合成方法。

背景技术：

五甲川花菁素类化合物是一类重要的有机染料广泛应用于生物分析、激光染料、纳米材料等领域。该类化合物具有很高的摩尔消光系数，其最大的吸收波长可在600-700nm区域，可以有效地过滤生物体内的背景荧光，提高实验检测的信噪比。

在激发波长在600-700nm的荧光探针的商业化产包括GE公司的Cy5-NHS-ester、Cy5Maleimide等产品，然而这些产品水溶性较差，不利于对水溶液中的大分子进行标记，且连接的碳链较长，其较大的柔性不利于对生物大分子的结构和动态学特征进行精确地描述。而Alexei Toutchkine等人发展了Cy5.2-IA、neo-Cy5等一系列的化合物，虽具有较好的水溶性，但是由于化合物的亲水和疏水基团分布不均匀，存在明显的亲水端和疏水端，使得探针在溶液中的分布不均匀，从而影响实验结果的准确性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于巯基标记的五甲川花菁类染料的合成方法，它将五甲川花菁素类的化合物引入了多个亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；进一步减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针亲水端与疏水端分布不均匀、探针连接基团较长的问题。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它的合成步骤如下：

第一步，反应一：将1-1.5当量的化合物I和1-1.2当量的化合物II在1.5-3.5当量的醋酸酐中加热搅拌0.5-1小时，得到中间产物III；

第二步，反应二：将1当量的中间产物III与1.1-1.5当量的碘化钠在有机溶剂1中加热至40-70℃回流2-24小时，得到目标产物IV，即水溶性荧光化合物。

所述的化合物I结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的化合物II结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的有机溶剂1为甲醇与氯仿的混合溶剂或者甲醇与二氯甲烷的混合溶剂。

本发明具有以下有益效果：将五甲川花菁素类的化合物引入了多个亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；进一步减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、亲水基团与疏水基团分布不均匀、连接基团较长的问题；该荧光化合物作为一种蛋白质巯基标记的探针，可以有效降低背景荧光干扰，提高信噪比，同时，该荧光探针的柔性较小，有利于对生物大分子的结构和动态学特征的精确描述。本发明的荧光化合物的合成方法合成方法简便、毒性较小。

附图说明：

图1是本发明中背景技术结构示意图。

图2是本发明最终产物的结构示意图。

图3是本发明中反应示意图。

图4是本发明中的最终合成物与HPrK79C蛋白在pH＝7.410mM Tris的体系在25℃混合4小时后，过脱盐柱除去小分子后收集的HprK79C的蛋白的激发发射图谱。其中：虚线表示激发光谱，实线表示发射光谱。

具体实施方式：

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

具体实施方式一：参看图1-图4，本具体实施方式是采用以下技术方案：它的合成步骤如下：

第一步，反应一：取1当量化合物I的钾盐与1.2当量的化合物II的钠盐，加入1.5当量的氯乙酸酐，室温搅拌0.5小时；旋蒸除去溶剂，柱层析，用甲醇∶丙酮＝1∶7洗脱，得到相应的化合物III；

第二步，反应二：将所得到的1当量的化合物III与1.1当量的碘化钠在甲醇∶氯仿＝1∶1的溶剂中60℃反应24小时，过滤，旋蒸除去溶剂，得到对应的最终的产物IV；经核磁谱确认与目标产物吻合。

所述的化合物I结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的化合物II结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的有机溶剂1为甲醇与氯仿的混合溶剂或者甲醇与二氯甲烷的混合溶剂。