[发明专利]青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和发育调控领域，具体涉及一种青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用。

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目（Decapoda）、长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23.7万吨，年产值超过150亿元，青虾养殖已在我国水产养殖中发挥了举足轻重的作用。近年来，随着规模化养殖的不断扩大和消费需求的不断提高，培育出性状更加优良的新品种是当前青虾遗传育种的关键。

蜕皮抑制激素（molt-inhibting hormone，MIH）,是甲壳动物眼柄中合成分泌的甲壳动物高血糖激素（crustacean hyperglycemic hormone，CHH）家族中一种重要的神经肽，具有调控甲壳动物蜕皮、发育活动的作用。在甲壳动物中的多项研究发现，蜕皮抑制激素能够抑制甲壳动物的蜕皮的发生，是甲壳动物生殖和发育调控中一种重要激素。

RNAi（RNA interference, RNAi）技术是一种由双链RNA诱发的基因沉默技术。在细胞内能特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，使相应基因的表达关闭。RNAi被认为是在基因功能研究中最有效的方法之一，已成为甲壳动物重要基因的功能的研究等很多领域中的重要工具。然而目前，在青虾重要基因研究中的应用尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青虾蜕皮抑制激素基因及其在加速青虾蜕皮和生长中的应用。利用本发明提供的青虾蜕皮抑制激素基因设计合成的dsRNA，可以有效的加速青虾蜕皮的发生从而加速青虾的生长和发育，为培育发育快、生长好的青虾优良品种提供新的思路和有效手段。

青虾蜕皮抑制激素基因，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述青虾蜕皮抑制激素基因在加速青虾蜕皮和生长中的应用。

所述的应用，是利用RNA干扰技术，根据青虾蜕皮抑制激素基因序列的开放阅读框设计RNA干扰引物，然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩增，得到序列如SEQ ID NO:4所示，以SEQ ID NO:4进行体外转录合成dsRNA，将dsRNA注射到青虾的围心腔后，加速青虾蜕皮和生长。

所述RNA干扰引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

dsRNA是用上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3通过PCR扩增得到的PCR产物SEQ ID NO:4经纯化后，进行体外转录合成得到的。

将dsRNA注射到青虾的围心腔的注射剂量为每克体重注射2~6μg dsRNA，优选为每克体重注射4μg dsRNA。

应用的具体步骤如下：

首先根据青虾蜕皮抑制激素基因（MIH基因）序列SEQ ID NO:1，在其开放阅读框内设计RNA干扰引物，并在上述引物前添加T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAGGG），确定上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3，序列分别为：TAATACGACTCACTATAGGGGTAAACCTGACAGCGCAAGG

、TAATACGACTCACTATAGGGCCATCTGTTGAGCTGTTCCA（下划线为T7启动子序列）。

用上述含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3通过PCR扩增得到PCR产物（序列如 SEQ ID NO:4所示），经纯化后按照Transcript AidTM T7 High Yield Transcription kit (Fermentas, Inc., USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

dsRNA在青虾蜕皮发育中的应用：注射上述dsRNA分别到同期发育的雌性和雄虾青虾的围心腔后在六周内进行连续观察和数据统计。结果表明：dsRNA可以特异性的沉默MIH基因mRNA表达，并能显著的加速雌雄青虾蜕皮的发生和雄虾体重的增加。