[发明专利]一种姬松茸菌种液氮保藏方法

说明书

技术领域

本发明属于姬松茸领域，更涉及一种姬松茸菌种液氮保藏的方法。

背景技术

姬松茸Agaricus blazei murrill又名小松菇、柏氏蘑菇、巴西蘑菇，原分布于北美洲南部和南美洲北部部分地区，1965年，日裔巴西人将这种美味食用菌引入日本，日本岩出亥之助教授将其取名为姬松茸。姬松茸是一种夏秋生长的腐生菌，生活在高温、多湿、通风的环境中，具杏仁香味，口感脆嫩。姬松茸菌盖嫩，菌柄脆，口感极好，味纯鲜香，食用价值颇高，且营养价值也很高。姬松茸具有很高的药用价值，含有多种生理活性物质，如多糖、糖蛋白、核酸、脂质、甾醇类物质。

因姬松茸属于高温型菌类，其菌种在低温下不易保藏，在我们前期的试验中，发现其菌种在4～10℃冰箱保存至12d，菌种出现死亡，这将严重影响姬松茸的科学研究与生产应用。

菌种保藏的目的是使所需保藏的菌种保持生物活力，不衰退，不污染杂菌，不发生变异，尽可能接近原始菌株的状态。已有的研究表明，用液氮超低温保存菌种已被公认为保持菌种特性不变和存活力持久最为理想的方法。鉴于姬松茸菌种在低温下不易存活，而液氮超低温保存是一种比较理想的保藏方法的矛盾下，本发明申请人从培养基筛选、培养基条件、液氮降温程序等因素进行优化，寻找一种适合姬松茸菌种液氮保藏的方法，为姬松茸的科学研究与生产应用提供菌种保障。

发明内容

鉴于上述背景，本发明提供了一种姬松茸菌种液氮保藏方法。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的姬松茸菌种液氮保藏方法包括以下步骤：

（1）将姬松茸接种于M3培养基，正面放置于27～30℃恒温生化培养箱，培养8～10d；

（2）在无菌操作环境下，取新鲜菌块于灭菌的安培管，注入灭菌过的10~12wt%甘油，没过菌块，常温静置2.5～3.0h；

（3）把安培管放入程序降温仪，采用如下降温程序：在常温下以4℃/min降至4℃，再以1℃/min降到-40℃，后放入液氮罐中保存；

（4）启用液氮罐中保存的菌种时，将安培管迅速从液氮罐中取出，放入30℃恒温水浴锅，解冻5min，接种于M3培养基。

所述M3培养基：马铃薯150～180g/L，玉米粉75～100g/L，蔗糖18～20g/L，蛋白胨2.0～3.0g/L，KH₂PO₄ 1.8～2.0g/L，MgSO₄ 0.8～1.0g/L，VB₁ 10mg/L，琼脂条23～25g/L，pH值自然；

M3培养基的配制：将马铃薯去皮切成小块，加1L的蒸馏水，煮沸浸提，过滤，取滤液，接着加入玉米粉，煮沸浸提，过滤，取滤液，再加入琼脂条溶解，最后加入蔗糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄、VB₁溶解，用蒸馏水补足至1L。

本发明具有以下优点：

1、筛选到一种适合姬松茸菌种培养的培养基，与常规真菌PDA培养基相比，姬松茸菌种在这种培养基上生长速度快，长势均匀，菌丝浓密。

2、解决了姬松茸菌种在低温保藏下不易存活的问题。

3、获得了一套适合姬松茸菌种液氮保藏的方法，姬松茸菌种在这种保藏方法下，存活率达100%，且生长速度快，菌丝生长旺盛，其活力也高，不易发生变异，可长期保藏，避免为保持其存活需要定期转接而发生菌种污染、活力降低等不利因素。

附图说明

图1为姬松茸AbML11在PDA培养基上正面放置培养 ；

图2为姬松茸AbML11在PDA培养基上倒置培养；

图3为姬松茸AbML11在M1培养基上正面放置培养；

图4为姬松茸AbML11在M1培养基上倒置培养；

图5为姬松茸AbML11在M2培养基上正面放置培养；

图6为姬松茸AbML11在M2培养基上倒置培养；

图7为姬松茸AbML11在M3培养基上正面放置培养；

图8为姬松茸AbML11在M3培养基上倒置培养；

图9为姬松茸AbML11在M4培养基上正面放置培养；

图10为姬松茸AbML11在M4培养基上倒置培养。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1：姬松茸菌种在4℃冰箱保藏期限

1、试验菌株