[发明专利]一种猪Sox6蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种猪Sox6蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

猪肉是当今世界消费量最大的肉类产品。传统的饮食习惯使猪肉及猪肉制品长期以来占据着我国肉类消费的榜首。但随着人们生活水平的提高，消费者对猪肉品质的要求也越来越高。猪肉品质与肌纤维类型密切相关。提高Ⅰ型肌纤维在肌肉中的比例可有效地改善猪肉品质。Sox6是转录因子Sox基因家族的重要成员，参与肌纤维类型转化的调节，影响肌肉中Ⅰ型肌纤维的比例。因此，Sox6在猪肉品质调控方面有潜在的应用。天然猪Sox6存在于多种组织中，且以骨骼肌中的含量最丰富，但分离纯化难度大，而化学合成猪Sox6成本高，所以利用基因工程技术制备重组猪Sox6是解决上述问题的一个有效途径。

利用基因工程技术制备重组蛋白具有广阔的应用前景。到目前为止，已发展了多种蛋白质表达系统，如原核表达系统、酵母表达系统、高等真核细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统是最常用的一套原核表达系统，具有遗传背景和生化特性清楚、生长快，成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单和便于工业化生产等优点。长期以来，人们用大肠杆菌表达系统制备了无数种重组蛋白。

申请号：201410006972.1，发明名称：一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法的专利申请公开了猪Sox6基因编码区全序列，其完整编码区的核苷酸序列如该申请中SEQ ID No.1所示，其编码氨基酸序列如该申请中SEQ ID No.2所示。但猪Sox6功能研究和应用中迫切需要开发低成本、高产率、易纯化的制备重组猪Sox6的方法。猪Sox6蛋白质表达水平检测也迫切需要开发效价高、特异性好的猪Sox6多克隆抗体的制备方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种低成本、高产率、易纯化的猪Sox6蛋白体外表达的制备方法，另外还提供一种效价高、特异性好的猪Sox6蛋白多克隆抗体的制备方法。

本发明公开了一种猪Sox6蛋白的体外表达方法，具体为：

(1)构建用于表达C端融合6×His-Tag的重组猪Sox6的重组表达载体；

(1.1)引物设计及PCR反应：

设计的上游引物(pET-30a(+)-pSox6F)为5’-CCCAATTCCATTCTTCCAAGCAAGCCACCTCTC-3’(下划线为Nde I酶切位点，加粗部分为起始密码子)，下游引物(pET-30a(+)-pSox6R)为5’-AAACTCGAGGTTGGCACTGACAGCCTCTGG-3’(下划线为Xho I酶切位点)；

以本实验保存的含猪Sox6基因完整编码区的pMD19T-pSox6质粒为模板进行猪Sox6的PCR扩增(见申请号：201410006972.1，发明名称：一种克隆猪Sox6基因编码区全序列的方法)。PCR反应体系为：ddH₂O 20μl，上下游引物(10μm)各1μl，cDNA 3μl，2×Taq PCR master mix 25μl(总反应体系为50μl)。PCR反应条件为：95℃预变性3min，然后进行95℃30s，55℃30s，72℃3min，共35个循环，最后再72℃延伸10min；

(1.2)上述PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收，回收产物用Nde I和Xho I限制性内切酶双酶切后连接到经同样双酶切的原核表达载体pET-30a(+)的Nde I和Xho I位点上(参见Novagen公司载体图谱)；

(1.3)获得的重组表达载体pET-30a(+)-pSox6，经酶切鉴定正确后，再经DNA测序验证其序列正确性；

(2)重组表达菌株的构建

将验证正确的重组表达载体pET-30a(+)-pSox6经化学法转化到大肠杆菌株Rosetta(DE3)中，在LB固体平板(含50μg/ml卡那霉素)上37℃培养，挑取单菌落到4ml LB(含50μg/ml卡那霉素)液体培养基中，37℃、250rpm震荡培养过夜，按850μl菌液加入150μl灭菌甘油，混匀后-80℃冰箱保存，保存的菌株即为重组表达菌株；

(3)猪Sox6的诱导表达及纯化

(3.1)猪Sox6的诱导表达