[发明专利]检测尿液Clusterin含量试纸条的制备及应用

说明书

技术领域

本发明是一种急性肾脏损伤疾病的检测方法，具体涉及一种应用免疫胶体金技术研制的Clusterin检测试纸条，同时公开了其制备方法，属于疾病检测技术领域。

背景技术

急性肾损伤在临床是常见而严重的肾脏病变，其发病率和死亡率都很高，寻求具有高敏感性、特异性、易检测的新的肾损伤标志物一直是研究热点之一。簇集蛋白(Clusterin)是一种分子量为80KD的异二聚体糖蛋白，广泛存在于人类及动物的许多组织中，急性肾损伤(acute kidney in jury,AKI)时，尿簇集蛋白表现出抗凋亡作用，并与脂肪利用、细胞聚集及黏附有关。虽然它在多种组织广泛表达，但由于其相对分子质量较大，不能从肾小球滤过，因此只有在肾损伤时才能在尿中检测。动物研究表明当肾毒素、肾切除术后、多囊肝性肾病和肾细胞瘤引起的急性肾损伤时，Clusterin能在肾损伤后的去分化肾细胞中表达增加，在鼠、狗和灵长类动物的尿中均可检测出来。因此检测尿中Clusterin水平可以间接评价急性肾损伤和药物肾毒性的情况。

目前国内外检测Clusterin的方法包括免疫组化、ELISA、Western blot、PCR等，但用于临床则存在很多弊端，如有创、操作程序复杂、时间较长等。

发明内容：

本发明的目的是公开一种用于检测尿液Clusterin含量的胶体金试纸条及制备方法，用于急性肾损伤和药物肾毒性安全性监测。

本发明提供的Clusterin的胶体金试纸条，适用于工业化生产，基本原理为双抗夹心法，具体安装方法参考了中国专利99203566.X、200510200394.6等，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的单克隆Clusterin抗体1胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的单克隆Clusterin抗体2，质控线包被有正常羊抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。

本Clusterin的胶体金试纸条的制备，包括以下步骤：

1将自行制备的纯化单克隆Clusterin抗体1用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将自行制备的纯化单克隆Clusterin抗体2和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有Clusterin抗原时，则于金标垫与胶体金标记的Clusterin抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的Clusterin抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。

本发明试剂盒的使用方法如下：取尿标本约0.1-0.5ml加入小试管中，然后插入试纸条，待1-2分钟反应带清晰后观察结果(见图2)。出现1条红色(对照)沉淀线，为尿检诊断阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，为尿检诊断阳性，未出现沉淀线则为无效。

本发明的积极效果在于：应用免疫胶体金技术制备Clusterin试纸条,可以快速，灵敏检测尿中Clusterin蛋白含量，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，无专业技术人员均可操作。样本用量小，对操作者无毒性，并且检测手段无创，除可用于临床急性肾损伤的检测还可用于药物肾毒性安全性监测。制备试纸条所用单克隆抗体为杂交瘤技术自行制备，费用低。

附图说明

图1.为Clusterin检测装置示意图；

图2.为Clusterin试剂盒检测结果判定示意图；

图中：1-样品垫，2-金标垫，3-硝酸纤维素膜，4-吸水垫，5-PVC板，6-检测线，7-质控线。

具体实施方式

实施例1Clusterin单克隆抗体的制备

用Clusterin蛋白(美国BD公司)多次免疫Balb/c小鼠，最后一次加强免疫后第3天取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞株X63-Ag8.653杂交融合(融合剂为聚乙二醇)，制备杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌Clusterin单克隆抗体的细胞株制备抗Clusterin的单克隆抗体1、2，测定单克隆抗体1、2效价，ELISA验证2者混合后效价叠加，证明1、2是针对Clusterin蛋白抗原上不同的抗原决定簇。

实施例2Clusterin胶体金试纸条的制备: