[发明专利]一种凤梨柱头可授性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物的杂交育种技术领域，具体涉及一种检测凤梨柱头可授性的方法。

背景技术

植物柱头的可授性检测是植物杂交育种中的一个重要环节，柱头可授性的高低大大影响自交和杂交的成功率。一般在杂交育种前，都需要对植物柱头是否可授、可授持续的时间及可授区域进行检测，以进行母本的选择及授粉时机和授粉区域的判断。

本发明利用植物柱头表面有多种酶及特异蛋白存在,并且这些酶和蛋白的活性及浓度会随着柱头接受花粉能力的变化而改变。这些酶活性的变化可以通过多种方法进行检测,从而反映出植物柱头可授性的改变。目前几种植物柱头可授性的检测方法都是基于对酶活性的检测，其中最常用的方法是联苯胺-过氧化氢法，原理是通过反应液与柱头上的酶接触后，能在溶液中呈现出蓝色并伴有气泡，依据此蓝色的深浅与气泡的多少可作出该柱头可授性强或弱的判断，一般以+、-表示。但该法在实际使用中也出现了如下的问题：1、开花初期可授性低时其溶液变色不明显；2、开花后期其可授性由强变弱时虽气泡已减少，但其溶液呈深蓝色，而少量气泡在深蓝色液中较难观察到；3、由于上述现象的存在容易导致主观性的产生，从而对目测判断结果带来偏差进而影响其准确性。

此外，在新鲜凤梨柱头的表面还包裹着一层含有蛋白质、脂类、多糖和酚类物质的分泌物，此类物质一方面对水溶性药剂表现出不亲和，从而在柱头表面形成一保护层，阻碍了柱头上的酶与反应液的接触而影响检测的结果；另一方面随着柱头逐步老化，上述的分泌物也会逐渐减少直至消失，但与此同时柱头的可授性也逐步自然降低直至消失。因此，使用传统的联苯胺-过氧化氢法测定凤梨柱头的可授性，容易出现对可授性的误判：即在柱头可授性旺盛的时候由于分泌物的隔离导致柱头上的酶与反应液没有充分接触而作出可授性弱的误判；而在柱头老化可授性降低的时期，由于分泌物的减少，导致柱头与反应液的充分接触，反应液颜色变浓而作出可授性增强的误判。设法消除上述的误判也是本发明必须设法解决的任务。

发明内容

本发明目的是，针对已有方法中存在依赖目测容易产生误差和柱头分泌物会在柱头形成保护层，阻止柱头的酶与反应液接触从而影响检测结果的缺陷，提出一种客观、量化的凤梨柱头可授性的检测方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现：

一种凤梨柱头可授性的检测方法，该方法按如下步骤进行：

(1)反应液的配制：将德国产Peroxtesmo KO过氧化物酶试纸和蒸馏水按1片:1ml比例浸渍形成反应液或将1％联苯胺和3％过氧化氢及水按体积4∶11∶22比例配制成联苯胺-过氧化氢反应液；按柱头体积大小将100-200ul的反应液转移到离心管中，备用；

(2)凤梨柱头的准备：将不同开花期的凤梨柱头，在距柱头20-30mm处割断，备用；

(3)柱头吸光值A1与A2的测定：将割断后的凤梨柱头按柱头朝下，倒置插入离心管中，至柱头浸入反应液中而花柱基部切口露于液面上，柱头在反应液中浸渍30s后，柱头的浸液部分和反应液显示出蓝色；对反应液采用紫外分光光度计658nm波长进行检测得吸光值A1；在反应液中加入0.02％-0.05％的表面活性剂后，再次将柱头浸入该混合液中30S后，用同样设备、方法测得吸光值A2；

(4)柱头可授性A值的计算：按公式A＝(A2-A1)×2计算，得出柱头可授性0至5的A值，其中，当柱头可授性很强时，A值趋近或等于5；当柱头可授性很弱或几乎没有时，A值趋近或等于0。

所述的表面活性剂为0.02％-0.05％的十二烷基苯磺酸钠、Tween80或Tween20。

本发明的有益效果是：

1、凤梨柱头表面的分泌物会形成保护层而影响反应液对柱头可授性的检测，本发明在反应液中再加入表面活性剂后，可以解决联苯胺-过氧化氢法中由此引发的误判问题。

2、利用柱头表面酶活性可随着柱头可授性的增强而增强，而柱头外包裹的分泌物会随着柱头可授性的减弱而减少的特性，通过表面活性剂加入前后吸光值的变化，可以判断柱头上酶活性强弱和柱头分泌物的多少，从而准确判断柱头可授性的强弱，较已有技术中用目测溶液颜色和气泡多少作判断，可更客观而准确。

3、柱头可授性通过吸光值的测量和计算公式来确定，表现为具体的数值，可通过图表进行横向比较和时间变化比较。

附图说明

图1凤梨柱头与反应液接触的设备、方式示意图

其中，1-离心管、2-反应液、3-花柱切口、4-花柱、5-柱头

具体实施方式