[发明专利]卵巢组织冻融后早期体外培养液及培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生殖医学领域，具体而言，涉及卵巢组织冻融后早期体外培养液及培养方法。

背景技术

近年来，女性生育力保护和保存已成为生殖医学领域亟需解决的重大课题。而在女性生育力保存技术中，卵巢组织超低温保存是最有潜力和最受关注的技术。具体的，先将人卵巢组织进行超低温保存；使用时对其进行解冻复苏，冻融后人卵巢组织的应用技术主要包括卵巢组织自体移植技术和卵巢组织体外培养技术。卵巢冷冻保存技术主要适用人群为年轻恶性肿瘤存活者，因而自体移植技术可能因卵巢组织自体移植使肿瘤细胞传播或再种植。由于对自体移植技术安全性担忧，使卵巢组织体外培养成为最有潜力的冻融后人卵巢组织临床应用技术，目前正逐渐成为生殖医学研究的新热点。

研究者一直致力于卵巢组织体外培养体系的改进和创新。目前，人卵巢组织体外培养采用多阶段序贯培养，其中早期阶段采用原位培养---始基卵泡不从间质组织中分离出来的原位培养方式。离体的卵巢组织或卵泡没有血供，其营养主要由培养液提供，所以培养液的选择对卵巢组织及卵泡的生长至关重要。

但是，由于人卵巢组织结构致密，间质中含有丰富胶原，培养液渗透到卵巢组织的中心非常困难，使得卵巢组织中心部位细胞(包括始基卵泡)不能充分吸收营养成分，妨碍了整个卵巢组织在体外的生长发育。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵巢组织冻融后早期体外培养液，以解决冻融后的卵巢组织在体外早期培养过程中，其中心部位不能充分吸收营养成分的技术问题。

本发明的另一个目的在于提供一种利用上述培养液来体外培养冻融后卵巢组织的方法。

在本发明的实施例中提供了卵巢组织冻融后早期体外培养液，用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：0.8-1.2份胶原酶和8.8-9.2份含有10％胎牛血清的L-15培养液；所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为8-12％人白蛋白、体积份数为0.8-1.2％的ITS，含量为0.2-0.4IU/ml的人卵泡刺激素、45-55μg/ml的维生素C、0.4-0.5mmol/L的丙酮酸、1.5-2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70-80IU/ml的青霉素和70-80μg/ml链霉素。

本发明提供的这种卵巢组织冻融后早期体外培养液，其包括用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；第一培养液是一种胶原酶溶液，冻融后的卵巢组织通过其处理之后，用胶原酶对胶原等组织的酶解作用，溶解部分胶原蛋白，使致密的卵巢组织间质疏松，有利于后续长期培养中第二培养液渗透，使第二培养液与同组织中不同位置细胞(尤其中央位置细胞)充分接触，有利于其充分吸收营养成分和排出代谢废物，从而更好的体外生长发育。

另外，本发明提供的第二培养液，其以α-MEM为基础培养液，且还包括体积份数为8-12％人白蛋白、体积份数为0.8-1.2％的ITS，含量为02-0.4IU/ml(体积份数为0.27-0.54％)的人卵泡刺激素、45-55μg/ml的维生素C、0.4-0.5mmol/L的丙酮酸、1.5-2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70-80IU/ml的青霉素、70-80μg/ml链霉素和8-12mmol/L的亮氨酸；既定浓度的各种有效因子可以保证预处理后的卵巢组织能够充分的吸收营养，为其体外产生长以及产生卵泡做好准备。更为重要的是，在第二培养液中，含有既定浓度的亮氨酸，由于亮氨酸是mTOR的激动剂，添加了亮氨酸的第二培养液能激活始基卵泡中mTOR的表达，从而解除对始基卵泡启动的抑制，使卵巢组织中多个始基卵泡同时获得激活，能够有多个卵泡同时发育，最大程度利用了卵巢组织中的卵泡储备，减少生育力储备的浪费。

一种根据上述培养液体外培养冻融后卵巢组织的方法，包括以下步骤：

将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织；

将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，在继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液。

可选的，在所述步骤将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织中，具体包括：

将冻融后的卵巢组织在无菌超净工作台上切成体积为1-1.2mm³的块状；