[发明专利]产生甲硫氨酸而不产生N-酰基甲硫氨酸

说明书

本申请是基于申请日为2009年8月21日，优先权日为2008年8月22日，申请号为200980141950.3(PCT/EP2009/060811)，发明名称为：“产生甲硫氨酸而不产生N-酰基甲硫氨酸”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物产生甲硫氨酸或其衍生物的方法。所述微生物和/或所述培养基和/或所述工艺参数经修饰使得副产物N-酰基甲硫氨酸(NAM)的积累减少。还要求保护从发酵培养基分离甲硫氨酸或其衍生物。

背景技术

含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢是至关重要的，且其在工业上被产生用作食物或饲料添加剂和药物。具体而言，不能由动物合成的甲硫氨酸(一种必需氨基酸)在许多人体机能中起重要作用。目前，D,L-甲硫氨酸是通过化学合成从丙烯醛、甲硫醇和氰化氢产生的。石油衍生前体丙烯醛和甲硫醇的价格增加连同甲硫氨酸的需求增加使得甲硫氨酸的微生物产生有吸引力。

在许多微生物中的L-甲硫氨酸合成途径是公知的(综述于Figge RM(2006),ed Wendisch VF,Microbiol Monogr(5)Amino acid biosynthesis p164-185)。大肠杆菌(E.coli)和谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)甲硫氨酸生产株已描述于专利申请WO2005/111202、WO2007/077041、WO2007/012078和WO2007/135188。

通过发酵产生的甲硫氨酸需要从发酵液纯化。甲硫氨酸的划算的纯化依赖于使发酵液中的副产物的量最小化的生产株和生产方法。“副产物”来源于甲硫氨酸转化和/或降解途径。具体而言，这些产物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、硫代甲基核糖和N-酰基甲硫氨酸(NAM)如N-乙酰甲硫氨酸和N-丙酰甲硫氨酸。如在专利申请PCT/EP2007/060433中所示，大肠杆菌甲硫氨酸生产株产生N-乙酰甲硫氨酸。大肠杆菌还产生N-丙酰甲硫氨酸。

NAM的产生是不理想的，因为其减少甲硫氨酸产量并使得甲硫氨酸纯化更加困难。可通过在发酵运行最后添加NAM酰基酶将NAM转化为甲硫氨酸和乙酸，但这极大地增加了产物的成品。因此，必需减少或消除NAM在发酵运行过程中的累积。这需要对导致NAM累积的反应的良好理解。

甲硫氨酸的N端乙酰化作为共翻译过程是真核生物中最常见的蛋白质修饰之一。尽管如此，N端乙酰化酶产生N-乙酰甲硫氨酸的可能性不大(对于综述，参见Polevoda&Sherman 2000 JBC 275,47,pp 36479-36482)，因为甲硫氨酸在甲硫氨酸产生细菌中表现为作为游离氨基酸而乙酰化，而在原核生物中作为共翻译过程的甲硫氨酸乙酰化是罕见的(Driessen等1985,CRC Crit.Rev.Biochem.18,281-325)。N-乙酰甲硫氨酸最可能是通过乙酰化游离L-甲硫氨酸获得的。已描述了可能能够乙酰化甲硫氨酸的N-乙酰化酶。例如，ArgA在大肠杆菌中编码N-乙酰谷氨酸合成酶(Marvil & Leisinger 1977 JBC252,10pp.3295-3303)。

迄今为止，尚未知有能够催化N-乙酰甲硫氨酸、N-丙酰甲硫氨酸或其它具有更长酰基链的甲硫氨酸衍生物的生物合成产生的酶。因此，主要的甲硫氨酸-N-酰基转移酶活性的鉴定及其在甲硫氨酸产生微生物中的减弱对于减少NAM产生至关重要。

NAM累积还可通过将累积的NAM脱乙酰获得甲硫氨酸来减少。来自氨基酸的N-酰基基团的脱乙酰化已在细菌中得到阐明。例如，ArgE编码的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶具有广谱底物，并有效地将N-乙酰甲硫氨酸脱乙酰基(Javid-Majd & Blanchard 2000 Biochemistry 39,1285-93)。因此，argE或其它氨基酸脱乙酰酶如大鼠肾酰基酶I(Giardina等2000 Eur.J.Biochem.267,6249-55)，来自黑曲霉(Aspergillus niger)或猪肾的氨基酸酰基酶(Gentzen等.1980 Z.Naturforsch 35 c,544-50)的过表达可减少NAM的累积。