[发明专利]一种表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，尤其涉及一种表达巢蛋白的睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途。

背景技术

随着社会老龄化问题的进程，中老年健康问题得到国际广泛关注。迟发性性腺功能减退症(Late-onset hypogonadism.LOH)已经成为严重影响中老年男性健康和生活质量的重要疾病之一。LOH的核心机制是分泌睾酮的睾丸间质细胞随着年龄的增长，数量减少和功能下降，导致体内的雄激素缺乏。睾酮不足最终可导致性欲、性功能的减退，还可造成疲劳、肌肉体积减少、脂肪体积增加、骨质疏松、贫血等症状，同时影响情绪与智力下降等严重影响活质量和引发多器官功能损害(Int J Androl,2009.32:1-10)。因此，睾酮水平的维持对男性意义重大。目前，睾酮替代治疗是解决睾酮缺乏的主要手段，临床上主要使用的是外源性睾酮制剂，按照给药途径可以分为口服睾酮制剂、肌注睾酮制剂、经皮肤黏膜吸收睾酮制剂以及睾酮埋置剂。许多研究表明睾酮替代治疗已取得了良好的治疗效果，例如：提高性欲、改善勃起功能、增加性满意度。但随后有报道显示其治疗效果会随着时间的推移逐渐减弱；LOH患者的腰椎骨密度增加；效果难以持久。其原因在于给药后血清睾酮浓度存在高峰和波谷，无法模拟机体睾酮的生理情况，也无法很好地预测个体的吸收模式。同时，外源性睾酮能够通过抑制下丘脑-垂体-性腺轴，继而导致睾丸局部睾酮浓度下降，最终引起精液质量下降，甚至导致男性不育。另外，体内雄激素水平升高可能会增加痤疮、男性乳房发育、前列腺癌、脂质代谢紊乱、心血管事件等。因此，中老年男性性腺功能低下患者使用雄激素替代治疗目前存在比较大的争议。为此，研究人员一直在探索更为安全、有效、质优价廉的LOH治疗方法。

葛仁山等人总结了成体睾丸间质细胞的发生过程，包括了四个发生阶段：睾丸间质干细胞(stem Leydig cell，SLC)、睾丸间质祖细胞(Progenitor Leydig cell)、不成熟睾丸间质细胞(immature Leydig cell)、成体睾丸间质细胞(Adult Leydig cell)。其中，睾丸间质干细胞可以在体外扩增并分化成为具有睾酮分泌能力的睾丸间质细胞。在大鼠出生后7天，梭形的睾丸间质干细胞主要分布在大鼠睾丸间质部分以及血管周围。Davidoff等认为睾丸的血管即血管平滑肌细胞及周细胞是睾丸间质细胞的前体细胞，被认为最理想的种子细胞(Davidoff MS,Middendorff R,Enikolopov G,Riethmacher D,Holstein AF,Muller D.Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cells revealed.The Journal of cell biology 2004；167:935-944)。这一研究成果提示可以利用少量储存的干细胞治疗LOH患者进行治疗，提高其临床应用前景。然而，目前对睾丸间质干细胞的研究甚少，大多数局限在对其细胞器，组织结构和细胞分布上。对睾丸间质干细胞的体外分离及培养的探讨，仅有应用Percoll密度梯度离心法，结合PDGFR-α阳性且LHR阴性细胞的免疫选择(Immunoselection)法，纯化出大鼠睾丸中PDGFR-α阳性且LHR阴性的细胞，并对其假定的睾丸间质干细胞做了体外增殖培养、定向分化为睾酮分泌的睾丸间质细胞。葛仁山等人将分离得到的睾丸间质干细胞移植入睾丸间质细胞损伤大鼠模型中，证明了睾丸间质干细胞可以在体内定植，并分化成有功能的睾丸间质细胞。这些研究，提示大鼠中的睾丸间质干细胞可以在体外进行培养和扩增，但是现行方法存在获得细胞量少，细胞种类不明确，缺乏细胞鉴定标准等众多弊端，明显制约了临床应用，需要进一步的深入研究。