[发明专利]以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术

尿素是人体蛋白质代谢的终产物，由肝脏产生，经血液运输至肾脏以尿液形式排出。尿素的生成量取决于蛋白质的摄入量、组织蛋白质的分解代谢以及肝功能状况。尿素是临床及生物化学一个重要的目标分析物，它是评价尿毒症毒素水平、肾脏及肝脏细胞功能的重要标志。目前，尿素的测定方法包括：氨电极法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法，脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法等。

近年来，荧光金属纳米团簇作为一种新型的荧光纳米材料备受关注。金属纳米团簇是指在一定的分子层保护作用下，由几个到几百个金属原子构成的分子级聚集体，其直径一般小于2 nm，接近于电子的费米波长（约0.7 nm）。由于其独特的物理、电学和光学性质，金属纳米团簇在单分子光电、催化、生物成像和传感器等领域显示出广泛的应用前景。在所有的金属纳米团簇材料中，金纳米团簇（gold nanoclusters，AuNCs）因其具有化学性质稳定和生物相容性好等优点，是目前研究最多的一种金属纳米团簇材料。与小分子荧光染料和荧光蛋白相比，AuNCs用作荧光探针具有水溶性好、比表面积大、表面易于修饰、抗光漂白能力强以及荧光性质可调等优点。因此，金纳米团簇有望弥补一些有毒小分子荧光染料的不足，甚至可以取代某些光稳定性差的传统荧光探针。

本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针，建立了一种尿素测定的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能直接用于尿素的含量测定。

所述金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素测定液按体积比为4：4：1混合，25°C反应40分钟测定发射光强度值F₆₅₀以判断尿素的浓度。

所使用的脲酶浓度为10 U/mL。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液。

利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀）以判断尿素含量，所使用的激发波长为355 nm。

将金纳米团簇溶液和脲酶溶液混合均匀后，将不同浓度尿素溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应后，测定发射光强度值F₆₅₀，在尿素浓度为0.055~0.55mmol/L的范围内F₆₅₀与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。

本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，用pH=6.0的缓冲液稀释，取0.05 mL稀释液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液和0.2 mL、浓度为10 U/mL的脲酶溶液组成的混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀，通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。