[发明专利]基于外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于胞外外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为1730亿t，所含总能量可达2×10¹⁸kJ，相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，它涉及众多酶系的参与。 

木质纤维素中的纤维素组分是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，性质稳定；纤维素降解需要纤维素酶的参与，纤维素酶并不是一种简单的酶，而是由若干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系统，主要由3类组成：内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶(Endo‐β‐1,4‐glucanase)，又被称为Cen酶；外切葡聚糖酶(Exoglucanses)，又被称为Cex酶；β‐葡萄糖苷酶(β‐glucosidase)，又被称为BG酶。目前普遍接受的观点是3种酶协同作用于纤维素的降解过程，即首先由Cen酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由CB酶将纤维二糖彻底水解为葡萄糖。因此，外切葡聚糖酶(Cex)在纤维素彻底水解过程中起十分关键的作用。 

目前，各种纤维素酶基因均已在细菌中发现并被克隆。与真核生物纤维素酶基因相比，细菌纤维素酶基因具有不含内含子、易克隆、易表达及种类多等优势。其中灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)是一种常见的土壤细菌(或放线菌)。之前，链霉菌研究重点为如何改造其代谢途径以提高抗生素尤其是链霉素的发酵产量，对其基因组内其他功能基因的开发和利用还相对不足。 

与大多数细菌相比，链霉菌具有较为复杂的生长分化机制，对大分子多糖物质如纤维素有很强的分解利用能力。因此，研究链霉菌对大分子多糖物质的分解利用机制，发现全新的纤维素酶基因序列并对目的基因进行外源表达，对新型纤维素酶制剂的开发及生产具有重大意义。 

经过对现有技术的检索发现：中国专利文献号CN101307295公开(公告)日2008.11.19，公开了一种表达嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)热稳定外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris GS－CBH3－27。通过RT－PCR及RACE方法从嗜热毛 壳菌获得外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3，然后将得到的外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3表达载体pPIC9K/cbh3导入到毕赤酵母GS115中，从中筛选出了表达外切－β－1，4－葡聚糖酶的酵母工程菌GS－CBH3－27。该工程菌外切－β－1，4－葡聚糖酶表达量高达1.7mg/mL，酶在60℃是稳定的，在70℃保温60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期为10min，具热稳定性，用于转化植物纤维素的生物降解，具有较高经济价值和社会价值。但该工程菌在碱性条件下的酶学性质难以满足现有工业需要。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的由于外切葡聚糖酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于外切葡聚糖酶的工程菌及其实现方法，通过构建外源表达载体，优化蛋白诱导表达的条件和融合标签等方法，实现了外切葡聚糖酶的胞外过表达，本发明不仅在高温条件下具有较高的生物学活性，此外在碱性条件下也可以维持稳定的酶学性质。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种外切葡聚糖酶的工程菌，该工程菌为外源表达外切葡聚糖酶的大肠杆菌。 

所述的胞内外切葡聚糖酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1胞外外切葡聚糖酶基因SG‐CX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该外切葡聚糖酶核苷酸序列为1737bp，共编码578个氨基酸，其中信号肽切割位于N端第32个氨基酸与第33个氨基酸之间。