[发明专利]一种快速提取油菜微量DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因组DNA制备技术领域，具体涉及到一种快速提取油菜微量DNA的方法。

背景技术

油菜是世界上重要的油料作物之一，是重要的食用植物油来源，也是重要的工业原料及蛋白饲料源。菜油是我国自产食用植物油的重要来源，在我国油料作物产油量中所占比例已达57.2％以上，因此，油菜生产在我国经济、生活中占有举足轻重的地位

油菜是一个异源四倍体植物，基因组相对复杂，随着生物技术突飞猛进的发展，多种分子标记已被大量应用于油菜品种的真实性和纯度的鉴定。DNA的提取是是进行分子标记分析的第一步，其效率和质量十分重要。目前，油菜的DNA提取通常采用CTAB法，其技术步骤较为复杂，耗时太长，并使用含有酚、氯仿等有毒试剂，需要借助通风橱进行操作，不利于在育种工作的广泛推广应用。为解决上述DNA提取中存在的不足，本发明提出了一种简便快捷、成本较低、无毒害的快速提取微量DNA的方法，提取的DNA可以满足分子标记分析的需求，且与传统的DNA提取方法相比，标记分析的效果没有显著差别。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速提取油菜微量DNA的方法，该方法与现有的植物DNA提取方法(如改良CTAB法)相比，可以极大地简化提取工艺、缩短时间和节约成本。

本发明是通过以下技术方案实现：

本发明所利用的材料是甘蓝型高油酸油菜(例如代表品系为甘蓝型油菜甲A177，甲A254，参见华中农业大学发明专利授权，专利号ZL2009102734352，授权公告号CN101824472B)幼嫩叶片。

一种快速提取油菜微量DNA方法，其步骤如下：

(1)采集甘蓝型油菜幼嫩叶片9-10mg装入2ml离心管，置于冰盒中；

(2)加入250ul提取缓冲液Buffer及钢珠，磨样机中研磨3min；

(3)置于94-100℃水浴培养10min，或水浴培养不超过12min，避免影响质量；

(4)在12000rpm下，离心5min；

(5)吸取上清液，或根据需要，最多吸取50ul上清液，加入超纯水稀释9-10倍，于-20℃保存或取2-3ul直接用于PCR反应；

其中：

所述提取缓冲液Buffer的配方，由500ml 1M的Tris-HCl(pH7.5)，17.55g NaCl和102.6g蔗糖加蒸馏水定容至1L后混匀配制而成。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明所涉及的快速提取法与改良的CTAB方法进行比较，它省去了常规方法中的氯仿：异戊醇(体积比24:1)抽提、无水乙醇沉淀DNA及风干和再溶解等过程，大大节约了提取DNA的时间和成本；

2、本发明所提取的DNA通过后期的PCR扩增，能够快速完成油菜大群体的筛选和后期研究，大大提高了油菜基础研究和遗传改良中的大群体筛选效率，使油菜基因克隆、分子标记辅助育种、转基因检测等方法简单化、快速化、常规化。

附图说明

图1：为2种DNA提取方法的电泳结果泳道。图中标记说明：M：本发明的实验室自制3KB Marker；泳道1、2、3、4的抽提方法为常规CTAB方法；泳道5、6、7、8方法为本发明提出的快速提取法；泳道1和5、2和6、3和7、4和8为相同样品。

图2：为PCR扩增产物actin基因(GenBank accession:AF111812.1)的琼脂糖凝胶电泳图。图中标记说明：泳道1～4:改良CTAB抽提DNA的PCR产物；泳道5～8:为本发明快速抽提DNA的PCR产物。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1：油菜DNA的提取方法建立

选取甘蓝型高油酸油菜(例如代表品系为甘蓝型油菜甲A177，甲A254，参见华中农业大学发明专利授权“专利号ZL2009102734352，授权公告号CN101824472B)幼嫩叶片，使用下述两种平行的方法分别进行提取油菜基因组DNA的比较试验。

1、DNA常规提取方法(即改良的CTAB法)

1、子叶DNA提取技术。在前人常用的DNA提取法(Porebski et al,1997,Plant molecular biology reporter,15:8-15)的基础上进行了改良，简称一次抽提法。

具体操作步骤如下：