[发明专利]重组人表皮生长因子的新型制备方法

说明书

技术领域

该发明涉及生物化学领域中对人表皮生长因子的克隆表达，具体包括利用DNA重组以及发酵技术获得高产量和高活性的重组人表皮生长因子。

背景技术

人表皮生长因子（EGF）是一种由53个氨基酸残基组成的分子量为6kDa的小分子多肽。广泛存在于许多组织器官和体液中，可促进上皮细胞生长增殖，能够对皮肤起到保护作用。其主要是利用其促进皮肤组织细胞的增殖与生长，使年轻新生的细胞替代衰老的细胞，从而起到抗衰老和护肤保健等功能。所以，EGF添加于护肤品中有抗衰老、增加弹性等功能，对受损伤的皮肤，能自动地进行护理，调养和修复。本发明提供工程菌株RoEGF-1和用其制备EGF的方法。包括利用大肠杆菌偏爱密码子合成hEGF基因；构建表达质粒pET27-S-EGF，能够表达hEGF与蛋白标签S的融合蛋白；用表达质粒pET27-S-EGF转化宿主菌并筛选得到工程菌株RoEGF-1；将工程菌RoEGF-1在大肠杆菌培养基中用IPTG诱导表达rhEGF。该方法能够高效稳定表达可溶状态的rhEGF蛋白，没有包涵体沉淀且没有额外的氨基酸残基残留。

发明内容

本发明提供了：1）经过人工改良的更适合于大肠杆菌表达的人EGF基因序列；2）利用S标签与传统表达载体pET-27b(+)相结合，提高rhEGF蛋白的产量与活性，克服大肠杆菌原核表达所带来的包涵体不可溶性和不正确折叠引起的低活性等缺点。

工程菌株的构建：

天然人EGF由53个氨基酸残基组成，由159个碱基对组成的DNA进行编码。天然的人EGF的DNA序列在编码的密码子中有一些密码子并不是大肠杆菌所偏爱的编码，因此，基因序列的改良能够在一定程度上提高大肠杆菌表达人EGF蛋白的产量。

大肠杆菌表达蛋白有以下两个比较严重的缺陷，1是T7启动子比较强力，诱导表达蛋白的速度过快容易形成没有活性且不可溶的包涵体蛋白；2是由于原核生物体内没有糖基化系统，且体内环境与真核生物不同，不能有效地正确折叠形成正确的二硫键，从而造成蛋白有时虽可溶但没有或者很少有活性。为了克服这几个比较严重的缺陷，本发明在合成基因的同时加入了标签蛋白，S标签能够有效地增加蛋白在大肠杆菌中的表达产量，并且同时能够大幅度地帮助蛋白进行正确折叠，而且蛋白经过特殊蛋白酶切割后能够不残留多余的氨基酸残基。在融合蛋白的N端加入NcoI，C端加入BamHI的酶切位点，经过优化的DNA序列见图1与图2。将该序列与pET-27b(+)均用NcoI与BamHI酶切后进行连接并转化至DH5α菌种中进行扩增（具体见图3）。

将扩增出的表达载体质粒用化学转化的方式转化至Rosetta表达菌株中。利用该工程菌进行蛋白表达（具体见图4）。

该工艺是在现有的成熟的基因工程技术的基础上进行的改进发明，其中对于EGF基因DNA序列的优化是现今其他人所没有的；同时将标签的高表达性、辅助折叠特性与pET27载体的可靠性、高表达性相结合，表达出具有活性的EGF蛋白，该技术产量高活性好，基本没有蛋白包涵体沉淀，表达出的蛋白全部可溶；表达条件简单，仅为基础培养基，没有过多复杂的操作步骤与配方，成本低廉。另外，由于蛋白上有His组氨酸标签，所以在分离纯化上十分简便，回收蛋白纯度95%以上，实验证明带有His+S标签的蛋白也具有生物活性，如果对蛋白的要求不高可以不去除标签，这样的纯化方式更加简洁，如果对蛋白要求高，可以采用专用蛋白酶进行切割，去掉His+S标签，可以达到不残留氨基酸残基的水平。

实施例1：pET27b(+)-S-EGF重组载体质粒的构建

1、按照图1中所示的序列进行DNA合成。

2、将含有合成的基因（连接在克隆载体上）的细菌（XL10gold）穿刺培养物进行扩大培养，利用质粒提取试剂盒提取出含有S-EGF的质粒（操作按照试剂盒说明书进行）。

3、对提取出的质粒与pET27b(+)载体分别进行酶切。