[发明专利]一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于检测人白蛋白的试剂盒。 

背景技术

人白蛋白（human serum albumin, HSA）是人体血液中最为重要成份，含量达到42 g/L的水平。其主要功能是维持血液渗透压的平衡、运输人体营养物质、保持细胞中内含物的稳定性等多种功能。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿是指尿中白蛋白含量超出健康人参考范围，但不能用常规的方法检测出这种微量的变化。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白作为糖尿病、肾病、心血管疾病等慢性病的早期诊断指标，对尿中白蛋白定量检测具有重要的临床意义。因此，建立特异、灵敏的检测尿微量白蛋白的方法具有重要的应用价值。 

目前，用于检测尿中白蛋白含量的方法主要是酶联免疫吸附实验（ELISA），该方法检测白蛋白要比溴甲酚紫（BCP）法和溴甲酚绿（BCG）（这两种方法的灵敏度为1 μg/ml）、蛋白质电泳法（0.5 μg/ml）的灵敏度和特异性要高的多，是目前检测尿中微量白蛋白早期诊断的主要方法。据报道，专利ZL2009201520440所述的一种人极微量白蛋白ELISA检测试剂盒，其灵敏度可以达到0.15 ng/ml（150 pg/ml）的水平。目前开发出的ELISA检测试剂盒中，最为灵敏的检测人白蛋白试剂盒是美国Cloud-Clone Corp公司生产的高敏人白蛋白检测试剂盒（货号HEB028Hu），其灵敏度可以达到0.048 ng/ml（48 pg/ml）的水平，其灵敏度是专利ZL2009201520440试剂盒的3.13倍，这对于尿中微量白蛋白的检测水平明显的提高了一个台阶。但是，在临床上，检测白蛋白灵敏度在pg级水平（48 pg/ml）仍然难于达到一些慢性疾病的早期检测要求，如妊娠子痫前期、2型糖尿病等疾病。在一些药物中，如人的细胞因子中残留的白蛋白的检测，要求其检测试剂盒具有更高的灵敏度。 

另一方面，医药级基因重组人血清白蛋白纯度的检测，没有一种有效的办法对白蛋白的纯度直接进行检测，这是由于2个方面的因素：1）用蛋白质电泳法、HPLC法、目前开发最为灵敏的ELISA法，其最低检测限度只能达到48 pg/ml的水平，即检测灵敏度不够，达不到白蛋白纯度检测的要求；2）医药级人白蛋白要求检测纯度要求达到99.999999%的水平。因此，目前在检测医药级基因重组人血清白蛋白只能采用间接推算的办法：把总蛋白质含量定义为100%，而且假设医药级白蛋白药物中只含2种蛋白质，即人白蛋白和宿主细胞蛋白质，如果检测出宿主细胞蛋白质的含量，就可以推算出人白蛋白的含量，公式如下。 

人白蛋白的含量=总蛋白质-宿主细胞蛋白质。 

目前多数生产厂家采用Cygnus Technologies公司生产的Pichia pastoris Host Cell Proteins Kit检测试剂盒（简称PPC检测试剂盒，Cat. NO.: F140）检测宿主细胞蛋白质的含量。但是，显然这种计算方法是有缺陷的、不全面的，因为在纯化后的医药级基因重组人血清白蛋白中，理论上讲，应该含有三种成份，公式如下。 

总蛋白质=人白蛋白+宿主细胞蛋白质+其他杂质蛋白质。 

在这个公式中，其他杂质蛋白质包括：人白蛋白降解的小片段、来源于培养基的残留蛋白质和生产过程中外界污染的蛋白质。 

按照美国药典（USP35 N27）的定义和日本三菱制药公司厂标的要求，医药级基因重组人血清白蛋白的含量要达到99.999999%。所以，直接检测白蛋白的含量是最佳的办法。本发明所涉及的人白蛋白检测试剂盒的灵敏度达到了0.0012 pg/ml的水平，比目前最为灵敏检测试剂盒的检测灵敏度（48 ng/ml，美国Cloud-Clone Corp公司生产）整整提高了4万倍。经过实验发现，本发明涉及的超级灵敏人白蛋白检测试剂盒，可以直接检测医药级基因重组人血清白蛋白的含量。 

综上所述，本发明涉及一种人白蛋白超敏ELISA检测试剂盒具有很好的实用价值。 

发明内容

本发明的目的在于：提供一种人白蛋白超级灵敏的ELISA检测试剂盒。 

本发明的目的是这样实现的：涉及到一种杂交瘤细胞株11A2，其特征在于：在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号：CGMCC NO.9243。保藏日期：2014年5月28日。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。