[发明专利]超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

脂溶性维生素泛指可溶于脂肪及脂溶剂的一类维生素。本发明主要针对其中对人体正常生长代谢及机能调节至关重要的9种维生素进行分析，包括维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素。

其中，维生素A对于良好的视力、胚胎和婴儿的正常发育、免疫系统的功能、生长、骨骼的形成、繁殖及伤口的愈合都是必不可少的；α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚是维生素E的三种常见形式，它们是高度活跃的自由基清除剂，保护脂质膜不被氧化，α–生育酚阻抑了蛋白酶C的活性，γ–生育酚作为活性氮氧化物，是一种对抗在体内引发疾病的化合物的强大后卫；胡萝卜素中比较重要的β-胡萝卜素可以转换成维生素A，胡萝卜的摄入有助于消除动脉硬化、癌症、眼疾等疾病的发生；蕃茄红素是目前被发现的最强抗氧化剂之一，它可以有效防治因衰老、免疫力下降引起的各种疾病；辅酶Q10是一种强还原剂，能防止脂质过氧化；叶黄素是一种性能优异的抗氧化剂，可抵御氧自由基在人体内造成细胞与器官损伤，另外对于保护视力、降低白内障的发生率、延缓动脉硬化、抗癌等都有非常重要的意义。

上述这些脂溶性维生素与人体正常生长发育，代谢功能都息息相关，其在血清中含量的检测对考察这些物质在体内的代谢途径、探查疾病机理以及考察某些药物的作用效果等等都有着指导意义。目前尚未见同时检测这9种物质的方法的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够利用超高效液相色谱技术同时测定血清中9种脂溶性维生素的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

超高效液相色谱技术测定血清中9种脂溶性维生素的方法，所述的9种脂溶性维生素分别为：维生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、辅酶Q10、番茄红素和叶黄素；

采用超高效液相色谱仪检测经过预处理的血清中的上述9种脂溶性维生素，通过样品的响应值的大小与标准品的比较计算上述9种脂溶性维生素的含量，具体色谱条件为：

(1)色谱柱型号：BEH C18 1.7μm*2.1μm*50mm；

(2)流动相：

流动相A：0.1％v/v三氟乙酸水溶液；

流动相B：乙醇；

流动相C：0.1％v/v三氟乙酸甲醇溶液；

流动相梯度见表1，流动相按照表1中的梯度保留时间均匀变化；

表1 流动相梯度洗脱参数

表2 波长切换参数

(3)流速：初始流速0.2mL/min，匀速提升至4.51分钟时升到0.3mL/min，8.51分钟再匀速下降，至8.6分钟时降至0.2mL/min；；

(4)柱温：30℃；

(5)采用可调紫外可见光检测器，进行多波长切换，具体波长切换条件见表2；

(6)进样量：1μL。

其中，所述的血清为人或动物的血清。

其中，所述的经过预处理的血清按照如下方法制备得到：取200μL血清加入1.5mL离心管中，向其中加入200μL冷冻乙醇涡漩2min，加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，取出上清液，离心后的沉淀部分加入800μL冷冻的0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡漩10min，3000rpm离心20min，合并上清液，氮气流上吹至近干，然后用100μL冷冻乙醇复溶涡旋60s，过0.2μm滤膜。

其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：

(a)标准品母液配制：分别称取维生素A 8.8mg、δ-生育酚10mg、γ-生育酚10mg、α-生育酚9.11mg，分别加入1mL含有0.4g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的乙醇溶液，另称取α-胡萝卜素10mg、β-胡萝卜素17.12mg(纯度99.9％)、蕃茄红素10mg(纯度90％)、辅酶Q105mg(纯度98％)、叶黄素20mg(纯度98％)分别定容于2mL、10mL、1mL、1mL、10mL正己烷中，分别得到各自标准品母液；