[发明专利]一种与肝癌相关的血液miRNA标志物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与人类肝癌相关的血液miRNA标志物及其应用；具体涉及人类血液中肿瘤源性的exosome来源的miRNA-26a和miRNA-199a的组合及其在诊断肝癌中的应用。

背景技术

微小RNA(micro RNA，简称miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA，长约18-24nt。微小RNA来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)。miRNA前体转运至胞质后，被进一步加工成miRNA。

微小RNA在动植物细胞中通过对目标mRNA的切割和转录抑制发挥重要作用，参与细胞生长、组织分化和肿瘤形成等多种过程。miRNA在物种间具有高度的保守性、时续性和组织特异性。目前认为miRNA在细胞凋亡、增殖、分化、血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用，参与人体大约30％的基因调节，与肿瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊乱及代谢紊乱等多种发病有关。在上述疾病中，miRNA与肿瘤的关系是很多研究的重点。已经发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。miRNA的正调控靶基因现象是最近的发现，具体机制还不明确。有学者提出了“癌microRNA”(OncomiRs)”的观点即认为某些miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。miRNA的表达主要由miRNA基因首先表达为miRNA前体(pri-miRNA)，pri-miRNA经转运出核后，由Dicer酶剪切成为pre-miRNA，pre-miRNA表现为典型的茎环结构，茎部序列不完全互补配对。其茎部序列经剪切后成为成熟体miRNA从而发挥生物学功能。

Exosomes是一种纳米级的小囊泡状结构，存在于血液或其他生物体液中。它形成于众多细胞(包括树突状细胞和肿瘤细胞)的胞吐作用。Exosomes的外膜是由脂质双分子层组成，其成分包含有选择性蛋白、mRNA和miRNA。在Exosomes中包含有大于120种的miRNA，exosome中的miRNA可以影响干细胞变异(let-7)、器官形成(miR-1)、造血作用(miR-181)、肿瘤发生(miR-17、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-19b-1、miR-93-1)以及新陈代谢。

肝癌是世界上第五大常见的癌症，也是死亡率排行第三的癌症。80％的肝癌常与慢性乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染有关。如此高的致死率是因为缺乏敏感而特异的无创性指标来进行早期诊断。由于早期肝癌症状不明显，通常在晚期才得以确诊，那时，由于大多存在癌细胞肝内或/及肝外转移，病人已经丧失了手术切除病灶的机会。目前，肝癌的诊断主要依赖于影像学上发现肝内肿物，包括超声、CT、核磁共振(MRI)等，同时结合血清中的肿瘤标志物如AFP等。但是，这两种方法的敏感性及特异性都不是十分令人满意。因此开发一种高敏感性和特异性的肝癌诊断方法是亟待解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种与人类肝癌相关的血液miRNA标志物，所述标志物是exsome来源的miRNA-26a和miRNA-199a的组合，miRNA-26a的序列信息如SEQ ID NO.1所示；miRNA-199a的序列信息如SEQ ID NO.2所示。使用本发明的miRNA标志物来进行肝癌的早期诊断，灵敏性和特异性均优于现有技术。

本发明还提供了与人类肝癌相关的血液miRNA标志物在制备诊断人类肝癌的试剂盒中的应用，所述标志物是exsome来源的miRNA-26a和miRNA-199a的组合，miRNA-26a的序列信息如SEQ ID NO.1所示；miRNA-199a的序列信息如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述与人类肝癌相关的血液miRNA标志物的检测试剂。所述试剂包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物；所述反转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物；对于miRNA-26a来说，所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引物；对于miRNA-199a来说，所述扩增引物的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，所述扩增引物的下游引物为通用反向引物。在本发明的一个具体的实施方案中，所述通用反向引物购自北京旷博生物技术有限公司。