[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的人肺炎衣原体快速检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae，Cpn)抗原的快速检测方法及检测试剂盒，以及该检测试剂盒的制备及使用方法。

背景技术

肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae，Cpn)作为衣原体属的一种重要的呼吸道病原微生物，自从上个世纪80年代中期由Grayston等人正式命名，在随后的时间里被研究者们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主，感染方式可能为人与人之间通过呼吸道分泌物传播。5岁以下儿童极少受染，8岁以上儿童及青年易被感染，尤其是人群聚集处，如家庭、学校、兵营中易流行，经血清流行病学调查，证实成人中至少有40％已受到该衣原体感染，大部分为亚临床型。肺炎衣原体是专性细胞内寄生的微生物，寄居于人呼吸道和咽喉等处，在儿童和成人中产生上呼吸道和呼吸道感染，常引起肺炎和支气管炎等呼吸道疾病。目前研究表明，其还与动脉粥样硬化综合症、老年痴呆症、心肌炎、哮喘等疾病有关。临床上由于其与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、x-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。

尽管肺炎衣原体在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，肺炎衣原体感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。检测血清中肺炎衣原体IgG、IgA、IgM抗体常用的有5种方法：微量免疫荧光抗体检测(MIF)，补体结合试验(CF)，重组酶免疫测定(rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验(SeroCF—EIA)，OY酶免疫试剂盒(LoY—EIA)。这5种方法要求肺炎衣原体不同成分做为抗原，而且肺炎衣原体抗体的检出只能说明该个体感染过肺炎衣原体，却不能反映体内是否仍有肺炎衣原体活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的时间。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。

核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交检测肺炎衣原体的特异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较高的敏感性，应用肺炎衣原体外膜蛋白基因片段的一对特异性引物对临床咽拭子进行PCR测定，其结果与血清学检测具有较好的一致性。但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。

抗原检测方法有鸡胚卵黄囊分离培养和细胞培养法(常用HL和Hep-2两种细胞)，然后采用荧光标记或酶标记抗体检测标本中的衣原体，但该法存在操作步骤复杂，细胞培养时间长等明显缺陷，并不适合临床应用。近年也尝试直接应用于临床标本的检验，其敏感性与标本采集有关：痰液和咽拭子涂片后用EIA可检测肺炎衣原体抗原的存在，其敏感性、特异性和可重复性不理想，且仅限于急性呼吸道感染；酶联免疫吸附试验(ELISA)也可以直接检出病原体，主要检测肺炎衣原体外膜蛋白-2，所用抗体为抗衣原体属特异性抗体，不能直接识别肺炎衣原体，与“金标准”(MIF)相比，虽然很灵敏，特异性却不高。

因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的人肺炎衣原体抗原快速检测法以满足临床的检测需求就显得非常必要了。

发明内容

针对背景技术中存在的这些技术问题，本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记的能简便、快速、高灵敏度的检测人肺炎衣原体抗原的检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于磁性分离和量子点标记的检测人肺炎衣原体抗原的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体的制备；

2)鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体的制备；

3)将步骤1)制备得到的兔抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体与纳米磁珠通过共价偶联，制备抗人肺炎衣原体免疫纳米磁珠；

4)将步骤2)制备得到的鼠抗人肺炎衣原体98KD膜蛋白多克隆抗体与纳米量子点通过共价偶联，制备量子点标记的抗人肺炎衣原体纳米探针；